揚州大學現(xiàn)代分子生物學5-分子生物學研究方法(編輯修改稿)
2025-01-22 05:44 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 轉化 （ transformation） ： P151 感受態(tài)細胞（ Competent cells） ： 受體細胞經(jīng)過一些特殊方法（如： CaCl2等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，能容許有外源 DNA的載體分子通過，處于這種狀態(tài)下的細胞稱 ~ 將異源 DNA分子引入一細胞株系，使受體細胞獲得新的遺傳性狀 轉導？ 轉染？ 常用的轉化方法： ? 化學轉化（ CaCl2）法 ? 電擊法 常見的 DNA操作技術 化學轉化原理： 在 0℃ 冷凍處理時，處于 CaCl 2低滲溶液中的大腸桿 菌細胞膨脹成球形。 DNA可吸附于其表面。在短暫的 熱沖擊下，細胞吸收外源 DNA ，然后在豐富培養(yǎng)基內(nèi) 復原并增殖，表達外源基因。 常見的 DNA操作技術 常見的 DNA操作技術 P153 常見的 DNA操作技術 電擊轉化： 使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細胞，通過 高壓脈沖的作用將載體 DNA分子導入受體細胞。 菌液：生長對數(shù)期 場強 (最大轉化效率 )： 溫度： 04℃ 常見的 DNA操作技術 克隆的篩選： ? 抗生素基因。 ? 常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等 ? ?互補藍白斑篩選 ? 營養(yǎng)條件（自養(yǎng)、異養(yǎng)） 常見的 DNA操作技術 ?互補篩選 常見的 DNA操作技術 ? β半乳糖苷酶基因（ LacZ）的調(diào)控序列和氨基端（ N端） 146個氨基酸編碼序列的質(zhì)粒 ? 編碼 β半乳糖苷酶羧基端（ C端）部分序列的宿主細胞 ? IPTG/Xgal的培養(yǎng)基上篩選藍白斑 藍白斑篩選 Lac Z , IPTG Xgal X + gal （白色） （藍色） Lac Z（失活） , IPTG Xgal Xgal （白色） （白色） 常見的 DNA操作技術 藍白斑 常見的 DNA操作技術 轉化率的計算： ? 轉化體總數(shù)＝菌落數(shù)（轉化反應原液總體積 /涂板菌液體積） ? 插入頻率＝白色菌落數(shù) /藍色菌落數(shù) +白色菌落數(shù) ? 轉化頻率＝轉化體總數(shù) /加入質(zhì)粒 DNA的量（計算出每微克的轉化菌落數(shù)） 常見的 DNA操作技術 聚合酶鏈式反應（ PCR）技術 ? 1985年， 速擴增特定基因 DNA序列的方法 ? 原理 ：類似于天然的 DNA復制過程。將待擴增的 DNA片段和兩側互補的兩段寡核苷酸引物，經(jīng)過變性，退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴增倍數(shù)可達 2n 倍 常見的 DNA操作技術 反應體系 ? 模板 DNA： 待擴增的目的片段 ? 特異性引物： 人工合成的與待擴增的靶 DNA兩端序列互補的寡核苷酸片段， 1530bp ? DNA聚合酶 ? dNTP ? 含有 Mg2+的緩沖液 常見的 DNA操作技術 PCR的基本反應步驟： 1. 變性 ： 95℃ ，模板 DNA變性為單鏈； 2. 退火 ： 50℃ 左右，
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