分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(編輯修改稿)
2024-09-11 20:31 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 dNTP:反應(yīng)體系中達(dá) 100μM ～ 200μM 。 ? ３ ． Mg2+： Mg2+是 Taq酶的輔基濃度在 ， 濃度太低 Taq酶活力降低；太高反應(yīng)特異性降低 。 ? ４ ． 引物：根據(jù)目的基因兩側(cè)特定序列設(shè)計(jì) 。 引物約20堿基左右；Ｇ＋Ｃ含量在 40 ％ － 70％ 之間；引物內(nèi)部不能有回該序列；引物３ ’ 端不能互補(bǔ) 。 ? ５ ． Taq酶：它是從嗜熱桿菌中提取的耐熱性ＤＮＡ聚合酶 ， 在９５ ℃ 時(shí)３０分鐘還有５０ ％ 活力 。 ? ６ ． 變性溫度：在９３～９５ ℃ 之間使模板充分變性 。 ? ７ ． 復(fù)性溫度：５５ ℃ 左右 ， 此溫度選擇是根據(jù)模板 ? 和引物配對(duì)結(jié)合強(qiáng)弱而定 ， 它是反應(yīng)特異性的決 定因素 。 ? ８ ． 延伸溫度：７０～７２ ℃ 左右 ， 為 Taq酶最適反應(yīng) 溫度 。 ? １０ buffer: 500mM KCl ? 100mM TrisHCl () ? % 明膠 ? 1% TritonX100 ? MgCl2 ? ４ dNTP: 1mM ? 引物： TGGCCGAGCTG ? 模板： 20ng/μl ? Taq酶： 5u/μl ? PCR儀 ， 凝膠成像系統(tǒng) ， 電泳系統(tǒng) １ ． 向無菌的 500μl Eppendorf管中依次加入以下溶液： ? 反應(yīng)物 體積 ? 10 buffer ? 4 dNTP(1mM) ? MgCl2 (25mM) ? 無菌水 ? Taq酶 (1U/ul) 1μl ? 引物 2μl ? 模板ＤＮＡ (20ng) 4μl ? 總體積 25μl ? 2． 反應(yīng)體系混勻 ， 離心 ? 3． 在ＰＣＲ儀上按以下方式循環(huán) ? 94℃ 變性 １分鐘 ? 36℃ 退火 １分鐘 ? 72℃ 延伸 ２分鐘 ? 經(jīng)過 40個(gè)循環(huán) ? 4． 72℃ 延伸反應(yīng) 7分鐘 。 ? 5． 取 20μl反應(yīng)液加 4μl Loading buffer在 ? 6. ％ 瓊脂糖凝膠上 120伏 ， 電泳 2小時(shí) 。 ? 7. 在凝膠成像系統(tǒng)上觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié) 三、 PCR電泳檢測(cè) ? １ ． 記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ， 并估測(cè)ＰＣＲ擴(kuò)增 ? 產(chǎn)物分子量 。 ? 四 、 問題與討論： ? １ ． 簡述ＰＣＲ基本原理 ? ２ ． 進(jìn)行一次成功的ＰＣＲ反應(yīng)順注意 ? 哪些問題 。 一 、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)從植物組織中提取 RNA的方法 。 二 、 實(shí)驗(yàn)原理 RNA是一類極易降解的分子 ， 要得到完整的 RNA， 必須最大限度地抑制提取過程中內(nèi)源
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