【文章內(nèi)容簡介】 RNADNA雜交分子。 ZDNA： Rich, CGCGCG寡聚體，左手螺旋 環(huán)狀 DNA：線粒體 DNA,葉綠體 DNA，病毒DNA，質(zhì)粒 DNA等。 ? 原核生物 DNA聚合酶的作用 ? DNA polymerase I:去除 RNA引物，補(bǔ)平缺口，其 5′→ 3′外切酶活性可切除 UV引起的嘧啶二聚體。 DNA polymerase I用枯草芽孢桿菌蛋白酶切割得到了一個大片段 (Klenow 片段）具有 DNA聚合酶活性和3′→ 5′ 外切酶活性，小片段具有 5′→ 3′ 外切酶活性。 ? DNA polymerase II： 3′→ 5′ 外切酶活性起校正作用，可以修復(fù) DNA. ? DNA polymerase III：單體包括 9個亞基，活性形式是其二聚體，是 DNA復(fù)制過程的主要催化酶。 ? 此外，還發(fā)現(xiàn)了 DNA聚合酶 IV和 DNA聚合酶 V，參與DNA的修復(fù)。 ? 真核生物與原核生物 DNA復(fù)制的差異 （ 1）原核 DNA通常具有一個 ori，而真核生物染色體具有很多 ori。 （ 2）原核生物 DNA上的 ori，在一個復(fù)制過程尚未完成時，新的復(fù)制叉有 又在 ori處形成；真核生物在一條染色體完成全部復(fù)制之前，各 ori不再進(jìn)行復(fù)制。 （ 3）真核生物 DNA復(fù)制子稱為 ARS(autonomous replicating sequence),長約 150bp，含復(fù)制起始必需的保守區(qū)，并需要起始原點復(fù)合物（ ORC)的參與。 （ 4）真核生物 DNA復(fù)制速度慢，不到 1/20。 （ 5）真核生物的 DNA聚合酶與原核生物的不同。 中的主要是 DNA聚合酶 I, II,III。而真核生物的 DNA聚合酶包括： DNA聚合酶 α， β， γ， δ和 ε。 ? IS的特征： a、較小，約 1kb b、末端具有倒置重復(fù)序列 c、轉(zhuǎn)座時復(fù)制靶位點的一段 DNA(415bp)，插入靶位點形成兩端的正向重復(fù)序列。 d、除了 IS1外，已知 IS都只含有一個開放讀框，通讀則產(chǎn)生轉(zhuǎn)座酶。 ? 原核生物的 RNA聚合酶各亞基功能 α：核心酶組裝，啟動子識別 β， β’ ：組成 RNA聚合酶的催化中心 ω：功能不詳 ζ：不同 ζ識別不同啟動子 ? 真核生物的 RNA聚合酶 根據(jù) RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及對 α –鵝膏蕈堿的敏感性不同，真核生物的 RNA聚合酶分為三類： RNA聚合酶 I， RNA聚合酶 II和 RNA聚合酶 III。 聚合酶 細(xì)胞定位 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 相對活性 對 α鵝膏蕈堿 RNAP I 核仁 rRNA 5070% 不敏感 RNAP II 核質(zhì) hnRNA 2040% 敏感 RNAP III 核質(zhì) tRNA 10% 物種特異 ? 原核生物啟動子結(jié)構(gòu)特點 10區(qū)， TATA(A)， TATA box(Pribnow box) 35區(qū)， TTGACA 10區(qū)、 35區(qū)是 RNA聚合酶與啟動子結(jié)合位點，與 ζ因子有很高的親和力。 ? 真核生物啟動子結(jié)構(gòu)特點 25~30區(qū)， TATAAA， TATA box(Hogness box) 70~80區(qū)， CCAAT, CAAT box 80~110區(qū)， 富含 GC， GC box ? 原核生物與真核生物啟動子結(jié)構(gòu)的差異 原核生物的啟動子小，結(jié)構(gòu)簡單，除 10區(qū)的 TATA box,35區(qū)的 TTGACA， 30~70區(qū)為正調(diào)控因子結(jié)合序列， +1~20區(qū)為負(fù)調(diào)控因子結(jié)合序列。 真核生物啟動子較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除 2530區(qū)的TATA box,7080區(qū)的 CAAT box外，大多數(shù)啟動子還含有 GC box。 真核生物的 TATA box與 UAS的作用不同， TATA box決定轉(zhuǎn)錄的起始，而 UAS決定轉(zhuǎn)錄的起始頻率。 真核生物啟動子并不都含有 TATA box, CAT box, GC box，缺一或缺二的啟動子，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控由調(diào)控因子（蛋白）來完成。 ? 原核生物與真核生物 mRNA的特征比較 原核生物邊轉(zhuǎn)錄邊翻譯，真核生物 mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯在時空上是分開。 原核生物的 mRNA以 AUG(或 GUG,UUG)為起始密碼子，而真核生物的 mRNA幾乎都以 AUG為起始密碼子。 原核生物 mRNA半壽期短，只幾分鐘，而真核生物 mRNA的半壽期則長的多。 許多原核生物的 mRNA以多順反子的形式存在，而真核生物成熟的 mRNA絕大多數(shù)是單順反子 mRNA. 原核生物 mRNA 5’端無帽子結(jié)構(gòu)， 3’端沒有或只含很短 poly(A）尾，真核生物的 mRNA（線粒體、葉綠體 mRNA除外）一般 mRNA5’端具有帽子結(jié)構(gòu)， 3‘端有長的 poly(A）尾。 原核生物 mRNA起始密碼子前含有 712個核苷酸的保守區(qū)，與核糖體小亞基中 16S rRNA的 3’端互補(bǔ)，在 mRNA核糖體結(jié)合過程中起作用，稱為 SD序列 （ ShineDalgarno sequence),或 核糖體結(jié)合位點 （ ribosome binding site, RBS), 真核 mRNA無該結(jié)構(gòu)。 ? RNA修飾 有些 RNA，特別是 rRNA和 tRNA，會發(fā)生特異的化學(xué)修飾。 （ 1）甲基化， m7G （ 2）脫氨基， G→ I, C→ U （ 3）硫代， S取代堿基中的 O， U→ 4 硫尿嘧啶 （ 4）同分異構(gòu)化，堿基發(fā)生了替代， C→ ψ ? 密碼子與反密碼子識別的擺動學(xué)說（ wobble hypothesis): ? 密碼子與反密碼子的配對中，前二者 (密碼子的第 1位和第二位）嚴(yán)格遵守堿基配對原則，第三對堿基有一定自由度，可以擺動，使某些tRNA可以識別一個以上密碼子。 ? 反密碼子第 1位是 A或 C,只識別一種密碼子，即： AU,CG。反密碼子第 1位是 G或 U,可識別兩種密碼子，即 G/C,U。 U/A,G。反密碼子第 1位是 I,可識別三種密碼子，即： I/A,U,C。 ? 肽鏈的延伸 包括 AatRNA與核糖體 A部位結(jié)合 → 肽鍵形成 → 核糖體移位 AatRNA與核糖體 A部位結(jié)合 第二個 AatRNA在延伸因子 EFTu和 GTP的作用下，形成 Aa A位點， GTP 水解，釋放 +Pi。 肽鍵的生成 在肽基轉(zhuǎn)移酶（ peptidyl transferase)作用下，位于 A部位的 AatRNA與位于 P部位的 fMettRNAfMet 上的兩個 Aa之間形成肽鍵。 具體過程： A部位的 AatRNA上游離的 NH2 親核攻擊 P部位 fMettRNAfMet 的酯鍵（ fMetCOOACCtRNA), fMet與 tRNA分開，而與游離的 NH2 形成肽鍵， tRNAfMet游離出。 移位 核糖體沿 mRNA 5’ → 3’ 方向移動一個密碼子， tRNAfMet從 P部位移到 E部位，二肽酰 tRNA從 A部位移到 P部位，空出 A部位接受下一個 AatRNA。移位需要移位因子 EFG,并由 GTP水解供能。每合成一個肽鍵需要 2分子 GTP。原核生物肽鏈延伸需 EFTu,EFTs,EFG。 真核生物需要 EF1,EF2。 ? 肽鏈的終止 ? 當(dāng) A部位出現(xiàn)終止密碼子（ UAA,UAG,UGA)時，無AatRNA與之結(jié)合，釋放因子（ RF)識別這些密碼子并與之結(jié)合，水解多肽鏈與 tRNA間的酯鍵，釋放多肽鏈和 tRNA，大小亞基解體，蛋白合成結(jié)束。 ? 原核生物釋放因子有 RF1,RF2,RF3。真核生物只有一種釋放因子 RF. ? RF1識別 UAA,UAG。 RF2識別 UAA,UGA ? RF3與核糖體解體有關(guān)， RF3具有 GTPase, 水解GTP使肽鏈與核糖體分開。 ? 蛋白質(zhì)前體的加工 N末端 fMet, Met的切除 甲?；?(f)被脫甲?；杆? Met也常被切除。 二硫鍵的形成 氧化作用使兩個 SH形成 SS 特定氨基酸的修飾 （ 1）磷酸化： Kinase使含羥基的 Aa加上磷酸基團(tuán) （ 2）糖基化： Asp,Ser,Thr,Asn等側(cè)鏈上加上糖基。 （ 3）甲基化。（ 4）乙基化 （ 5）羥基化： Pro, Lys側(cè)鏈。（ 6）羧基化 非功能片段的切除 信號肽和非活性 Aa的去除。 ? 蛋白合成的抑制劑 多數(shù)常見抗生素是蛋白合成抑制劑，抗感染。 ? 氯霉素（ chloramphenicol)：阻止 mRNA與核糖體的結(jié)合 ? 四環(huán)素 (tetracycline)：阻止 AatRNA與核糖體的結(jié)合 ? 鏈霉素 (streptomycin)、新霉素 (neomycin)、卡那霉素 (kanamycin)：干擾 AatRNA結(jié)合而產(chǎn)生錯讀，如使編碼 Phe的密碼子 UUU翻譯成 Ile ? 嘌呤霉素（ puromycin):提前釋放肽鏈抑制蛋白合成。它是 AatRNA的類似物，進(jìn)入核糖體 A部位，與肽酰 tRNA反應(yīng)，多肽鏈的 C末端連接嘌呤霉素。 可抑制原、真核生物的蛋白質(zhì)合成?？勺鳛榭鼓[瘤藥物，抑制腫瘤細(xì)胞蛋白合成。 ? 信號肽假說（ signal peptide hypothesis) ? 信號肽（ signal peptide）： 某些新合成蛋白的 N末端含有的 1336Aa組成的氨基酸序列，與該蛋白的跨膜運(yùn)輸有關(guān)，具有以下特點（ 1）1015個疏水 Aa；（ 2）靠近信號肽 N末端帶有 1個或數(shù)個帶正電荷的 Aa；（ 3） C末端靠近蛋白酶切割位點處帶有數(shù)個極性 Aa,離切點最近的 Aa往往是帶有短側(cè)鏈的 Gly或 Ala。 ? 線粒體蛋白的跨膜運(yùn)轉(zhuǎn) 進(jìn)入線粒體蛋白質(zhì)多以前體形式存在，其 N末端帶有一段前導(dǎo)肽（ leader peptide)長約 2080Aa，當(dāng)前體蛋白過膜時，前導(dǎo)肽為多肽酶水解，釋放成熟蛋白 蛋白質(zhì)通過線粒體內(nèi)膜的運(yùn)輸是一種需能的過程 蛋白質(zhì)過膜運(yùn)輸時，首先由線粒體外膜上 Tom受體識別與 Hsp70或 MSF(mitochodrialimport stimulating factor)等分子伴侶結(jié)合的過膜多肽，通過 TomTim組成的膜通道進(jìn)入線粒體內(nèi)腔。 ? 核定位蛋白的運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制 核定位序列（ nuclear location sequence, NLS): 定位在細(xì)胞核中蛋白所具有的信號肽，但蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核后 NLS不被切除，且可能存在于蛋白質(zhì)的任何部位。 核蛋白的運(yùn)輸需要 （ 1）核運(yùn)轉(zhuǎn)因子（ importin, α、 β ) 。 （ 2）低分子量 GTPase(Ran) 運(yùn)轉(zhuǎn)過程 （ 1）核運(yùn)轉(zhuǎn)因子的 α 亞基識別核蛋白的 NLS，并與之結(jié)合。 （ 2） α –NLS核蛋白復(fù)合體與核運(yùn)轉(zhuǎn)因子的 β 亞基結(jié)合 （ 3）核運(yùn)轉(zhuǎn)因子 核蛋白復(fù)合體擴(kuò)散到核孔附近與核孔復(fù)合物結(jié)合。 （ 4） GTPase水解 GTP供能 ,將蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核， α、β 、核蛋白分開。 （ 5） α、 β進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)下一個蛋白。 ? 三引物法實時定量 PCR(Realtime quantative PCR)的技術(shù)原理 除了常規(guī) PCR的兩個引物外，反應(yīng)體系引入與模板DNA互補(bǔ)的第三個引物，該引物的 5’端帶有短波長的熒光基團(tuán)， 3’端帶有長波長的熒光基團(tuán)，兩者發(fā)出的熒光相互淬滅，檢測不到熒光。當(dāng)進(jìn)行 PCR時， Taq DNA 聚合酶可降解該引物，釋放熒光基團(tuán)，可檢測到其發(fā)出熒光，熒光強(qiáng)度與合成 DNA的量成正相關(guān)。 ? cDNA文庫（ cDNA library):將來源于某細(xì)胞或組織的全部 mRNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，再與質(zhì)粒 DNA連接轉(zhuǎn)化細(xì)菌，或噬菌體 DNA連接再包裝成噬菌體顆粒侵染細(xì)菌，得到一系列的克隆群體（菌落或噬菌斑），每一個克隆只含一種mRNA的信息，足夠數(shù)目的克隆總和則包括了細(xì)胞或組織的全部 mRNA信息，這樣的克隆全體就是 cDNA文庫。 ? cDNA文庫構(gòu)建方法 （ 1）高質(zhì)量 mRNA的制備 提取組織總 RNA(mRNA,tRNA, rRNA) → mRNA與生物素標(biāo)記的 Oligo(dT)結(jié)合 → 加入親和素標(biāo)記的微磁球 → 親和素與生物素結(jié)合 → 磁場分離微磁球（ mRNA結(jié)合在微磁球上） → 洗脫mRNA (2)反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 三種方法： a: Oligo(dT)為引物合成 cDNA b:由 6個堿基組成的隨機(jī)引物（ R6)合成 cDNA c: Ol