【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 仿 這類有機(jī)溶劑 不但能使核蛋白與核酸解聚 (但不能破壞核酸 )，而且對(duì)蛋白質(zhì)有變性作用。因而對(duì)酶 (RNase)有抑制作用。 酚不能完全抑制 RNase活性，但酚一般都加入了 8－羥基喹啉 (一種抗氧化劑，一種指示劑 )，因而加強(qiáng)了對(duì)RNase的抑制效果。氯仿的抑制效果比較強(qiáng)，因此酚與氯仿常聯(lián)合使用。 蛋白酶 K也能抑制 RNase活性。有一種情況挺特殊，即該酶在 1－ 2％的 SDS存在下，其活性反而會(huì)增加。 包括 SDS(十二烷基硫酸鈉 )， 十二烷酰肌氨酸鈉，脫氧膽酸鈉等陰離子去污劑。這些陰離子去污劑可使核酸與蛋白質(zhì)解聚，并可與蛋白質(zhì)側(cè)鏈上帶正電荷的基團(tuán)結(jié)合，在高濃度 KCl存在下，形成 SDS－蛋白質(zhì)復(fù)合物而沉淀。 （胍類）鹽酸胍， 異硫氰酸胍 ，作用非常強(qiáng)的一種蛋白變性劑，可完全破壞蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核酸與核蛋白分離，所以又稱解偶劑。 ③ RNase的特異抑制劑 a. RNase阻抑蛋白 (RNasin)，是一種酸性糖蛋白可與RNase以非共價(jià)鍵的形式結(jié)合，從而抑制 RNase活性， RNasin最好不與蛋白質(zhì)變性劑一同使用 ，因變性劑亦可破壞 RNasin ，從而使其喪失作用。但可與二巰基乙醇一同使用，可增強(qiáng) RNasin的使用效果。 ，這也是一種 RNase特異性抑制劑，幾乎可完全抑制 RNase的活性。 為達(dá)到完全、徹底抑制 RNase活性的目的， 常聯(lián)合使用 ，而且有些抑制劑 (去除蛋白質(zhì)物質(zhì) )一般有 4種作用； 破壞細(xì)胞膜，使核酸與蛋白質(zhì)分離，沉淀蛋白質(zhì)、抑制 RNase活性。 因此幾乎包括了 RNA提取、分離、純化的所有目的。 、提取方法 步驟： (1)創(chuàng)造一個(gè)無(wú) RNase環(huán)境； (2)組織或細(xì)胞的勻漿，同時(shí)得加入 RNase抑制劑 (3)裂解細(xì)胞； (4)去除蛋白、 DNA等大分子物質(zhì)； (5)沉淀 RNA； (6)漂洗； (7)溶解 RNA。 酚 ： 使核酸與核蛋白分離、變性沉淀蛋 白質(zhì)，抑制 RNase活性。 異硫氰酸胍 ：破壞裂解細(xì)胞，使核酸與核蛋白分離，變性沉淀蛋白質(zhì)，同是具有很強(qiáng)的 RNase抑制作用。這是一個(gè)關(guān)鍵的試劑，由于它是萬(wàn)能的，所以實(shí)驗(yàn)步驟變得簡(jiǎn)單。 Trizol試劑盒所提供的試劑： 自己需要配制的試劑 氯仿：蛋白質(zhì)變性作用，增強(qiáng)對(duì) RNase抑制作用。 異丙醇：沉淀 RNA。 75％乙醇：漂洗、去除鹽、殘留有機(jī)溶劑等雜質(zhì)。 無(wú) RNase水或 %SDS溶液 (后者較好 )(必須用 DEPC處理 )。 ① 勻漿化 ： 取 50100mg組織放在勻漿管中，加 1ml Trizol試劑，然后進(jìn)行勻漿，此時(shí)裂解細(xì)胞和 RNase抑制同時(shí)進(jìn)行。 ：倒掉培養(yǎng)液，然后直接向培養(yǎng)瓶 (皿 )中加入 Trizol試劑 (按 10cm2加 1ml Trizol試劑計(jì)算加入量 )。 ：離心收集細(xì)胞，然后加入 Trizol試劑（按 5～ 10 106或 1 107細(xì)菌加入 1ml比例計(jì)算加入量 )。 操作步驟 ② 兩相分離 將勻漿化的樣品在 15℃ ～ 30℃ 環(huán)境中放置 5min，以便核酸蛋白復(fù)合物充分解聚 。（加 Trizol試劑之前，樣品一定要保持低溫，防止 RNase 發(fā)揮作用，在研磨過(guò)程中可加液氮 ） 然后按每 1ml Trizol試劑加入 氯仿。蓋緊試管蓋，用手劇烈振蕩 15秒，之后在15?～ 30℃ 條件保溫 2～ 3min。離心： 12022g離心15min，離心時(shí)溫度要控制在 2℃ ～ 8℃ 。（ 12022g離心是一個(gè)關(guān)鍵步驟 ，也是該方法獨(dú)到之處，可 將蛋白質(zhì)， DNA等大分子沉淀 )。離心之后，就會(huì)形成三相：下層是紅色的酚和氯仿（含有蛋白質(zhì)和DNA）；中間層是白色的 DNA和蛋白質(zhì)沉淀；上層是水相， RNA就在此層，水相大約占總體積的 60％ ③ RNA沉淀 將水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的試管中，并加入異丙醇混勻，加入量按每 ml Trizol試劑加 。在 15?～ 30℃ 條件下，保溫 10min。然后在 2～ 8℃ 條件下， 12022g離心 10min，此時(shí)就會(huì)在管底或底部邊上出現(xiàn) RNA沉淀，離心之前， RNA沉淀通?？床灰姡x心之后常?？煽匆娔z樣沉淀。 ④ RNA漂洗 移去上清液，加入 75％乙醇至少 1ml，渦旋振動(dòng)幾次，然后以 7500g離心 5min(溫度 2?～ 8℃) ，又可形成 RNA沉淀，并移去上清液。 ⑤ 重新溶解 RNA 將 RNA沉淀在空氣中放量 5～ 10min，以便揮發(fā)掉殘留的乙醇。注意 干燥時(shí)間不宜太長(zhǎng) ，以防 RNA完全干燥。完全干燥的 RNA很難溶解。最后用無(wú)RNase水或 ％ SDS溶液溶解 RNA，并用移液管吹打幾次，并在 55℃ ～ 60℃ 保溫 10min，以便使 RNA完全溶解。 ⑥ 判定純度和計(jì)算含量，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量溶液的吸光度質(zhì)（ A）。 A260/280在 ～ ，符合實(shí)驗(yàn)要求。 1OD值＝ 40μ g RNA,據(jù)此再計(jì)算 RNA含量。 一般來(lái)講，該方法可從 1mg組織中提取的 RNA含量分別為： 肝和脾為 6～ 10μ g ；腎 3～ 4μ g ，肌肉和腦為 1～ 5μ g ，胎盤 1～ 4μ g 。 對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)講，1 106個(gè)上皮細(xì)胞中可提取 8～ 15μ g ，成纖維細(xì)胞5～ 7μ g 。 用 Trizol試劑盒法提取的 RNA， 基本上可滿足所有實(shí)驗(yàn)的需要 ，如 Northern blot，斑點(diǎn)雜交， mRNA分離、體外翻譯，分子克隆等。 該方法操作簡(jiǎn)便，提取的 RNA完整，整個(gè)提取過(guò)程僅需 1h，故現(xiàn)在廣泛使用。 第三節(jié) 核酸分子雜交技術(shù) ：在化學(xué)及生物學(xué)意義上的探針(Probe)，是指能與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用的分子，并可被特殊的方法所探知 (檢測(cè)到 )。所謂核酸分子探針則是指特定的已知核酸片段，并帶有標(biāo)記物，能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，因此可以用于待測(cè)核酸樣品中特定基因順序的探測(cè)（可定性、定量）。 (一 )探針的概念、種類及其選擇、探針的標(biāo)記 、選擇及特點(diǎn) 種類： 基因組 DNA探針、 cDNA探針、 RNA探 針、寡核苷酸探針 選擇： 寡核苷酸探針 寡核苷酸探針是指人工合成的短鏈核苷 酸片段，并帶有標(biāo)記物 特點(diǎn)： 人為控制，雜交時(shí)間短，特異性高，可 以用于點(diǎn)突變檢測(cè)；缺點(diǎn)是靈敏度低 設(shè)計(jì)寡核苷酸探針應(yīng)遵循的 （ 以下 ） 幾個(gè)原則： ① 探針長(zhǎng)度：一般要求 10～ 50bP。 過(guò)短則特異性降低 ， 過(guò)長(zhǎng) ， 則合成困難 、 雜交時(shí)間延長(zhǎng) ， 亦會(huì)出現(xiàn)非特異性雜交 。應(yīng)不短不長(zhǎng) 。 （ 一般 20bp） ② G： C堿基對(duì)含量應(yīng)占 40～ 60％ ；過(guò)少 ， 則不易雜交 ，或雜交雙鏈不穩(wěn)定；過(guò)多 ， 則會(huì)產(chǎn)生非特異性雜交 ， 應(yīng)不多也不少 。 （ 一般 AT、 GC各占 50%） ③ 探針內(nèi)部的互補(bǔ)堿基對(duì)不應(yīng)大于 4bP， 否則會(huì)形成探針內(nèi)部的 “ 發(fā)夾 ” 結(jié)構(gòu) 。 ④ 同一堿基的連續(xù)出現(xiàn)次數(shù)不應(yīng)超過(guò) 4次 。 ⑤ 探針設(shè)計(jì)完后 ， 最好利用基因庫(kù)軟件進(jìn)行分析 ， 并與已知的各種基因序列進(jìn)行同源性比較 ， 如果該探針與非目的基因序列有 70％ 以上的同源性 ， 或連續(xù)有 8個(gè)以上的堿基序列相同 ， 則應(yīng)重新設(shè)計(jì)探針序列 。 標(biāo)記物： 放射性核素： 32P、 35S、 3H、 125I、 131I 非放射性標(biāo)記物：半抗原（生物素、地高辛）；配體；熒光素；化學(xué)發(fā)光物 根據(jù)待測(cè)核酸分子存在的部位不同，可分固相 雜交（膜上印跡雜交、細(xì)胞原位雜交）和液相雜交。 其中膜上印跡雜交應(yīng)用廣泛。 膜上印跡雜交是指將待測(cè)核酸序列片段結(jié)合到 一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標(biāo)記的 核酸探針進(jìn)行雜交的過(guò)程。 （二）雜交 首先用凝膠電泳方法將待測(cè)核酸片段分離 ， 然后用 印跡技術(shù)將分離的核酸片段轉(zhuǎn)移到特異的固相支持物上 （ 轉(zhuǎn)移后的核酸片段將保持其原來(lái)的相對(duì)位置不變 ） 。 再用標(biāo)記的核酸探針與固相支持物上的核酸片段進(jìn)行 雜交 。 最后洗去未雜交的游離的探針?lè)肿?， 通過(guò)放射自顯影等檢測(cè) 方法顯示標(biāo)記的探針的位置及量的多少 。 概括起來(lái) ， 雜交主要包括三個(gè)步驟：印跡 、 雜交和檢測(cè) 。 膜上印跡雜交的基本操作流程 印跡技術(shù)是指將待測(cè)核酸分子 轉(zhuǎn)移 并結(jié)合到一定的 固相支持物 上的方法。 印跡技術(shù)主要包括兩個(gè)關(guān)鍵因素：選擇良好的固相支持物；有效的轉(zhuǎn)移方法。 ⑴ 固相支持物的選擇 ① 具有良好的機(jī)械性能，如柔軟性好，韌性強(qiáng)，以便操作 時(shí)不易損壞； ② 具有較強(qiáng)的結(jié)合核酸分子的能力； ③ 與核酸分子結(jié)合后，應(yīng)不影響其與探針?lè)肿拥碾s交反應(yīng)； ④ 與核酸分子的結(jié)合穩(wěn)定、牢固，能經(jīng)受雜交、洗膜等操 作過(guò)程，而不會(huì)脫落或脫落極少； ⑤ 非特異性吸附較少，即使有，在洗膜時(shí)也易被洗脫掉。 硝酸纖維素濾膜 尼龍膜 化學(xué)活化膜 濾紙 其中前 2種更為常用 目前常用的固相支持物 硝酸纖維素濾膜 具有較強(qiáng)的吸附結(jié)合單鏈 DNA和 RNA的能力 ，特別是在高鹽濃度 ， 其結(jié)合力可達(dá) 80μg/cm2～100μg/cm2。 這種結(jié)合主要靠疏水作用 。 非特異性吸附核酸 （ 探針 ） 能力較弱 ， 因此雜交信號(hào)本底值較低 。 常用于 Southern、 Northern斑點(diǎn)印跡及克隆篩選等實(shí)驗(yàn) 。 缺點(diǎn)： ① 與核酸的結(jié)合力較弱 （ 因?yàn)槭强渴杷饔?） ， 在雜交及洗脫的進(jìn)程中 ， 核酸會(huì)慢慢脫落 ， 特別是在高溫情況下 ， 更容易脫落 ， 從而使雜交率下降 。 另外硝酸纖維素膜對(duì)于小分子量 DNA片段結(jié)合力更弱 ， 因此不太適合小分子 DNA片段的雜交 。 ② 硝酸纖維素膜質(zhì)地較脆 ， 特別是經(jīng)烘烤后更易破損 ， 因此操作不方便 ， 須特別小心 。 另外值得注意的是 ， 硝酸纖維素膜與核酸的結(jié)合 ， 有賴于高鹽濃度 ， 而高鹽溶液又不適合于電轉(zhuǎn)印跡法 （ 電流大 ， 產(chǎn)熱 ） 。 尼龍膜 尼龍膜是目前較理想的一種核酸固相支持物 ， 它有多種類型 。 有的尼龍膜未經(jīng)特殊處理 ， 叫普通尼龍膜 。 有些則是經(jīng)過(guò)了正電荷基團(tuán)的修飾 ， 又叫特殊尼龍膜 。 特殊尼龍膜帶有正電荷 ， 核酸帶有負(fù)電荷 ， 因此二者可靠靜電吸引牢固結(jié)合 。 因此尼龍膜對(duì)核酸的結(jié)合力要比硝酸纖維素膜強(qiáng)好多倍 。 特別是經(jīng)短波紫外線照射后 ， 核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的帶正電荷的氨基相互交聯(lián) ， 從而使結(jié)合更加牢固 。 因此特別適用于小分子核酸片段的雜交 。 另外堿處理也可使核酸牢固地結(jié)合在尼龍膜上 ， 因此使 DNA的變性 、 吸附和固定可一步完成 ， 特別適用于菌落原位印跡法 。 尼龍膜質(zhì)地堅(jiān)韌 ， 不易損壞 ， 操作方便 ，可 進(jìn)行多次重復(fù)雜交 。 另外 ， 在低離子強(qiáng)度條件下 ， 也可與核酸牢固結(jié)合 ， 因此適用于電轉(zhuǎn)印跡法 。 缺點(diǎn)：由于結(jié)合力強(qiáng) ， 非特異性吸附較多 ，雜交信號(hào)本底較高 ， 應(yīng)注意封閉 。 ⑵ 印跡方法 轉(zhuǎn)移方法不同 ， 可分為 ① 斑點(diǎn)或狹縫印跡 ， 即直接將核酸樣品點(diǎn)樣于固相支持物上； ② 虹吸印跡法 ， 利用毛細(xì)管虹吸作用 ， 由轉(zhuǎn)移緩沖液帶動(dòng)核酸分子轉(zhuǎn)移到固相支持物上； ③ 電轉(zhuǎn)印跡法 ， 即利用電場(chǎng)力的作用將核酸帶到固相支持物上； ④ 真空轉(zhuǎn)移法 ， 即利用真空抽濾作用 ， 將核酸分子帶到固相支持物上 。 根據(jù)要轉(zhuǎn)印核酸品種的不同 ， 又可分為 Southern印跡法：是指將電泳分離的 DNA從 凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過(guò)程 。 Northern印跡法：是指 RNA的印跡過(guò)程 。 步驟： 。 酶切變成合適長(zhǎng)度的DNA片段 （ 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?， 突變檢測(cè)則短 ， 定性定量則長(zhǎng) ） 。 一般理想的是 ～ 10Kb， 因片段大小直接影響轉(zhuǎn)移效率 。 。 分離 DNA片段 ， 經(jīng) EB（ 溴化乙錠 ） 染色后觀察 DNA片段大小 ， 并與 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物比較 （ Marker） 。 記錄或照像各 DNA片段位置 。尤其留意我們所感興趣的 DNA片段 。 （ 瓊脂糖電泳常用于核酸 ， 一般為水平板電泳 SDS電泳常用于蛋