【文章內容簡介】 中含鹽量、總用水量等有關。天開機30分鐘沖洗一次，冬季每隔（4）使用過程若發(fā)現(xiàn)停機后泵仍頻繁地每隔數分鐘有規(guī)則地啟動數秒鐘又停機，此為管路漏水引起，需及時打開機箱加以解決。象，有利于沖洗和保護反滲透膜元件，十、消毒設備細菌和細胞培養(yǎng)以及核酸等有關實驗所用的試劑、RO純水或高純水出口閥門，則可獲得相應水質的純水。當高純水出口 115～3噸，約二至四個月更換一次，2～3避免遭到微生物繁殖和減少污物沉積。將電源插頭插入帶有接地線的為了獲得高質量的高純水，可以先放掉 35℃，產水量會隨溫度降低而下降，冬季保養(yǎng)溫實際使用壽命與自來水水質、2天。必須注意定期沖洗維護。夏季宜每 乃屬正常現(xiàn)尤其高溫季節(jié)。器皿及實驗用具，應嚴格滅菌，有的實驗～設備停運時間超過天開機沖洗一次。若每隔半小時以上啟動數秒鐘又停機，還要求沒有核酸酶的污染，故應將實驗器械，試劑等進行高壓消毒。對于經過導入DNA重組分子的菌株，操作后必須進行嚴格的高壓消毒滅活處理。大批實驗物品、試劑、培養(yǎng)基等可以使用大型消毒器進行消毒。一些不能經受高壓、高溫消毒的試劑可用濾器濾膜除菌，器皿可用紫外線照射、75%%的十二烷基硫酸鈉（SDS）浸泡消毒。所有的細胞培養(yǎng)、細菌培養(yǎng)的操作，都應在紫外線消毒后的超凈工作臺中進行。下面介紹立式自動壓力蒸汽滅菌器（LDZX40BI）的使用方法。（1）開蓋：轉動手輪，使鍋蓋離開密封圈。（2）通電：連接自動進水裝置。接通電源，將控制面板上電源開關按至低（LOW）紅燈亮，蒸發(fā)鍋內屬斷水狀態(tài)；缺水（（3）加水：打開水源，水位達到低水位，控制面板上低水位紅燈和缺水黃燈相繼滅，加熱（1綠燈）亮，繼續(xù)加水至高水位（（4）堆放物品：需包扎的滅菌物品，體積不超過包裝之間留有間隙，堆放在金屬框內，這樣有利于蒸汽的穿透，提高滅菌效果。（5）密封高壓鍋：推橫梁入立柱內，旋轉手輪，使鍋蓋下壓，充分壓緊。（6）設定溫度：通電后數顯窗燈亮，上層為紅色，顯示溫度，下層為綠色，設定溫度和時間。先按控制面板上確認鍵，綠色數顯閃爍，進入溫度設定狀態(tài)。按一次移位鍵指相應位置閃爍，根據所需數據位置進行（單項循環(huán)）移位。按△增加鍵或所需溫度設定。設定完畢，按二次確認鍵，進行溫度確認。（7）設定時間：按一次確認鍵，將溫度設定切換成時間設定；再按一次移位鍵，所指相應位置閃爍，完畢，按二次確認鍵，定時器開始倒計時。（8）滅菌：在加熱初，將下排汽閥打開至垂直位置；下排汽閥待蒸汽冒出時，壓力表顯示指示為的15%為宜。安全閥設定數，超出壓力部分，安全閥將自動泄壓，并開始計數滅菌所需時間。滅菌完成，電控裝置將自動關閉加熱系統(tǒng)，伴有蜂鳴提醒；并將保溫時間切換成控制面板上電源開關按至（9）干燥：物品滅菌后需要迅速干燥，須打開放汽閥和下排汽閥，將滅菌器內的蒸汽迅速排出，使物品上殘留水蒸汽快速揮發(fā)。根據所需數據位置進行移位；進行時間設定確認。℃時，將下排汽閥推向水平關閉位置；留有微量蒸汽逸出，以控制總汽流量使用最高滅菌溫度為OFF HIGH）綠燈亮，自動停止加水。按增加鍵或減少鍵，時間采用倒計時，124℃～126℃，ON處，若水位LACK）黃燈亮，電源已正常輸入。200mm100mm100mm為宜，各所??減少鍵，進行 進行所需時間設定。設定當滅菌鍋內溫度達到設定溫度，～；此時，將100壓力在處；關閉電源，停止加熱待其冷卻。（10）將蓋開啟，取出已滅菌物品。關閉水源，打開下排水閥，排盡滅菌室的水與水垢，以備下次使用。（1）堆放滅菌物品時，嚴禁堵塞安全閥的出汽孔，必須留出空位保證其空氣暢通，否則安全閥因出汽孔堵塞不能工作，造成事故。（2）滅菌液體時，應將液體灌裝在硬制的耐熱玻璃瓶中，以不超過選用棉花紗塞，切勿使用未打孔的橡膠或軟木塞，放蒸汽，必須待壓力表指針回零位方可排放余汽。（3）對不同類型，不同滅菌物要求的物品，切勿放在一起滅菌，以免顧此失彼，造成損失。實驗二質粒DNA一、實驗原理細菌質粒是一類雙鏈、閉環(huán)的在于細胞質中、獨立于細胞染色體之外的自主復制的遺傳成份，于染色體外的游離狀態(tài)，制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。DNA，大小范圍從在滅菌液體結束時不準立即釋 至200kb3/4體積為好，瓶口隨著染色體的復特別注意，的提?。瓑A裂解法1kb以上不等。各種質粒都是存通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，一般分離質粒DNA的方法都包括3個步驟：①培養(yǎng)細菌，使質粒DNA大量擴增；②收集和裂解細菌；③分離和純化質粒DNA。分離制備質粒DNA的方法很多，其中常用的方法有堿裂解法、煮沸法、SDS法、羥基磷灰石層析法等。在實際操作中可以根據宿主菌株類型、質粒分子大小、堿基組成和結構等特點以及質粒DNA的用途進行選擇。本實驗介紹堿裂解法提取質粒DNA。堿裂解法提取質粒DNA是根據共價閉合環(huán)狀質粒DNA和線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離質粒DNA。，線性的DNA雙螺旋結構解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉環(huán)質粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞，仍會緊密地結合在一起。，因為共價閉合環(huán)狀的質粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確，而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不會那么迅速而準確，它們相互纏繞形成不溶性網狀結構，而復性的質粒DNA恢復原來構型，保持可溶性狀態(tài)。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質SDS復合物等一起沉淀下來而被除去，最后用酚氯仿抽提純化上清液中的質粒DNA。二、儀器及試劑：37℃恒溫搖床、冷凍離心機、臺式離心機、微量移液器、50 ml離心管、 ml離心管管、槍頭、各種規(guī)格的量筒、接種環(huán)、試劑瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。：LB培養(yǎng)液的配制：酵母浸提物 g；胰蛋白胨 g；NaCl g；依次稱量后加入800 ml去離子水后攪拌至完全溶解，用5 mol/L NaOH（ ml）。再加去離子水將溶液定容至總體積為1000 ml，10磅高壓滅菌20 min，冷卻后4℃保存。溶液 Ⅰ（GET緩沖液）： 25 mmol/LTrisHCl（）, 10 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 葡萄糖配制：1000 mlmol/L TrisHCl（）ml mol/L EDTA（）ml20% Glucose（）mldH2O910ml將以上溶液混合裝瓶，10磅高壓滅菌20 min，冷卻后4℃保存。溶液II（變性液）：200 mmol/L NaOH，1% SDS配制： 500 ml10% SDSml2N NaOHml取以上溶液，用滅菌去離子水定容至500 ml，充分混勻。室溫保存，此溶液保存時間最好不超過一個月，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。注意：SDS易產生氣泡，不要劇烈攪拌。溶液 III(醋酸鉀液)：3 mol/L 醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 。5 mol/L 冰醋酸配制：500 ml醋酸鉀g冰醋酸 ml加入300 ml去離子水后攪拌溶解。待醋酸鉀溶解后，再加去離子水將溶液定容至高溫高壓滅菌后，4℃保存。10TE緩沖液（pH ）：100 mmol/L TrisHCl, 10 mmol/L EDTA配制：1000ml mol/LTrisHCl 緩沖液(pH )100ml500 mmol/L EDTA()ml加入約800 ml的去離子水，均勻混合。溶液定容至1 L。高溫高壓滅菌后，苯酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)：將量取25 ml TrisHCl（）平衡苯酚，加入 13500 ml。4℃保存。24 ml 氯仿和 1 ml 異戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。其它試劑：TE（）、異丙醇、氯仿/異戊醇（24:1）、無水乙醇、70％乙醇、氨卞青霉素貯存液（50 mg/ml）三、操作步驟(1）將5～10 ml含有氨卞青霉素（后接入一單菌落，并保持通氣良好，于接一次，于37℃ 220 rpm振搖培養(yǎng)(2） ml，轉入棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。（堿裂解法）（1）加100 ul 溶液Ⅰ 重懸細菌沉淀，用槍吹打直至混和均勻。（2）加200 ul溶液 Ⅱ，蓋緊管口，液變透明，粘稠）。（3）加150 ul溶液 Ⅲ，輕微振蕩混和（4）12000 rpm離心6 min，取上清液至另一離心管（棄沉淀）（5）加等量的酚/氯仿/異戊醇，旋渦混勻離心管。（6）加1倍異丙醇，振蕩混勻，靜置倒置于吸水紙，將附于管壁的殘余液滴除凈。（7）加200 ul 70％乙醇洗滌沉淀物，臺式離心機在室溫下晾干（或在50℃－60℃的烘箱中也可）（8）沉淀加20μl TE, 反復吹打使質粒四、常見問題及可能原因：變性不充分；關鍵步驟反應時間過短；離心時間或速度不夠。：操作過程中用力過猛，動作過大；操作系統(tǒng)內有污染。AP）的LB培養(yǎng)基加入到容量為100ml的三角瓶中，然37℃ 220 rpm振搖過夜培養(yǎng)（約16h）后可以再轉3～4 h。的離心管中，用臺式離心機以12000 rpm輕緩上下顛倒離心管以混合內容物。室溫靜置10 sec，置冰上10 min(溶液出現(xiàn)白色沉淀。1 min，12000 r/min離心6min，取上清液至另一10 min，12000 rpm離心6 min。棄上清液，將離心管 12000 rpm離心2 min，棄上清液，將沉淀。DNA充分溶解，－20℃保存。14 min。5 min（溶)。 ml離心 ：變性過程不完全；試劑配制有問題（成分，濃度或pH）。實驗三瓊脂糖凝膠電泳一、實驗原理瓊脂糖凝膠電泳是分離和純化的多孔支持介質（瓊脂糖凝膠）的樣品孔中，并置于靜電場上。由于架兩側帶有含負電荷的磷酸根殘基，分子的遷移速度取決于分子篩效應。因而可依據DNA可以分離相對分子質量相同，而構型不同的相對分子質量標準參照物和樣品一起進行電泳而得到檢測。以提供一個用于確定EB)，其分子可插入下，呈桔紅色熒光，因此也可對分離的一般瓊脂糖凝膠電泳適用于大小在膠的制備以及瓊脂糖凝膠電泳在二、儀器及試劑：水平電泳槽、電泳儀、100 ml或250 ml錐形瓶、量筒、吸頭等。：50TAE緩沖液的配制：配制1000 mlDNA 片段的常用技術。把DNA樣品加入到一塊包含電解質DNA分子的雙螺旋骨因此在電場中向正極移動。在一定的電場強度下，DNA具有不同的相對分子質量的DNA片段泳動速度不一樣，DNA，也DNA分子。在電泳過程中可以通過示蹤染料或相對分子質量標準參照物相對可DNA片段大小的標準。在凝膠中加入少量溴化乙錠(ethidium bromide, DNA的堿基之間，形成一種絡合物，在254～365nm波長紫外光照射DNA進行檢測?！?0kb范圍內的DNA片段。本實驗介紹瓊脂糖凝DNA片段分離中的應用方法。凝膠成像分析系統(tǒng)、微波爐、微量移液器、透明膠帶、點樣板或parafilm、2 mol/L Tris乙酸， mol/L EDTA（pH ）15 分子的大小來使其分離。凝膠電泳不僅可分離不同分子質量的Tris242 g冰乙酸 ml mol/L EDTAml加入600 ml去離子水后攪拌溶解，將溶液定容至1 L后。高溫高壓滅菌，室溫保存。1TAE緩沖液的配制：稱量20 ml的50TAE緩沖液，再加入980 ml的去離子水。溴化乙啶貯存液：10 mg/ml 溴化乙啶配制：100 ml稱取1 g溴化乙啶，置于100 ml燒杯中，加入80 ml去離子水后攪拌溶解。將溶液定容至100 ml后，轉移到棕色瓶中。室溫保存。6上樣緩沖液：%溴酚藍，%二甲苯青FF，30%甘油。配制：10 ml溴酚藍mg二甲苯青FFmg甘油ml用6TAE緩沖液定溶至10 ml，分裝成1 ml/管。20℃保存。其它試劑：DNA樣品、DNA Ladder、瓊脂糖、三、操作步驟％瓊脂糖凝膠(大膠用70ml，小膠用50ml)： g中，加入70 ml（50ml）1TAE，瓶口倒扣小燒杯。微波爐加熱煮沸搖勻，%瓊脂糖凝膠液。：取電泳槽內的有機玻璃內槽（制膠槽）洗干凈、晾干，放入制膠玻璃板。取透明膠帶將玻璃板與內槽兩端邊緣封好，形成模子。將內槽置于水平位置，好梳子。將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取 16 g）瓊脂糖置于錐形瓶3次至瓊脂糖全部融化，并在固定位置放（下膠帶，將凝膠及內槽放入電泳槽中。添加1TAE電泳緩沖液至沒過膠板為止。：在點樣板或parafilm上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數應不小于1X。用10 ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內，每加完一個樣品，應更換一個加樣頭，以防污染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序）。：加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，電壓60－100V，樣品由負極（黑色）向正極（紅色）方向移動。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當溴酚藍移動到距離膠板下沿約1cm處時，停止電泳。(5）電泳完畢后，取出凝膠， ug/ml的溴化乙錠1TAE用清水漂洗10 min。(6)觀察照相：在紫外燈下觀察，DNA存在則顯示出紅色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。四、常見問題及注意事項1．配瓊脂糖時應使其完全熔化后方可制膠。2．瓊脂糖凝膠易于破碎，操作時要輕緩。3．電泳時應注意電源線路，預防觸電。4．溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用時應帶乳膠或一次性塑料手套。并在專門的實驗室內使用。5．紫外線對人體有損傷作用，開燈時間不宜太長，注意防護。6．DNA帶形狀模糊：DNA加樣過多；電壓太高；凝膠中有氣泡。7．質粒DNA的存在形式有3種，①共價閉環(huán)DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在；②開環(huán)DNA（ocDNA），此種質粒DNA的兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，因此可以自由旋轉從而消除張力，形成松弛的環(huán)狀分子；③線狀