【文章內容簡介】 子密碼 (triplet coden) 。 mRNA 5’ GCU AGU ACA AAA CCU 3’ （三）遺傳密碼的性質 簡并性 由一種以上密碼子編碼同一個氨基酸的現(xiàn)象稱為簡并 （ degeneracy），對應于同一氨基酸的密碼子稱為 同義密碼子 （ synonymous codon）。 同工 tRNA （三） tRNA的種類 代表同一種氨基酸的 tRNA稱為 同工 tRNA。 同工 tRNA既要有不同的反密碼子以識別該氨基酸的各種同義密碼，又要有某種結構上的共同性，能被相同的氨基酰 tRNA合成酶識別（ P112）。 無義突變 ：在蛋白質的結構基因中，一個核苷酸的改變可能使代表某個氨基酸的密碼子變成終止密碼子（ UAG、 UGA、 UAA），使蛋白質合成提前終止，合成無功能的或無意義的多肽，這種突變就稱為無義突變。 錯義突變 ：由于結構基因中某個核甘酸的變化使一種氨基酸的密碼子變?yōu)榱硪环N氨基酸的密碼子，這種基因突變叫錯義突變。 GGA（甘氨酸） AGA（精氨酸） 在單個核糖體上，可化分多個功能活性中心，在蛋白質合成過程中各有專一的識別作用和功能。 ● mRNA結合部位 —— 小亞基 ● 結合或接受 AAtRNA部位（ A位 ） —— 大亞基 ● 結合或接受肽基 tRNA的部位 —— 大亞基 ● 肽基轉移部位（ P位 ） —— 大亞基 ● 形成肽鍵的部位（轉肽酶中心） —— 大亞基 四、蛋白質合成的過程 ? 氨基酸的活化 ? 翻譯的起始 ? 肽鏈的延伸 ? 肽鏈的終止 ? 蛋白質前體的加工 (一 )氨基酸的活化 氨基酸 + tRNA 氨基酰 tRNA ATP AMP＋ PPi 氨基酰 tRNA合成酶 第一節(jié) 基因操作的主要技術原理 1． 核酸的凝膠電泳 (Agarose amp。 Polyacrylamide) ? 將某種分子放到特定的電場中，它就會以一定的速度向適當?shù)碾姌O移動。某物質在電場作用下的遷移速度叫作 電泳的速率 ，它與電場強度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質的粘度系數(shù)等）。 ? 在生理條件下，核酸分子中的磷酸基團是離子化的，所以， DNA和 RNA實際上呈 多聚陰離子 狀態(tài)（ Polyanions）。將 DNA、 RNA放到電場中，它就會由負極 → 正極移動。 7. PCR技術 （基因的體外擴增法） ? (1).概念 PCR（聚合酶鏈式反應）技術 ： 是一種在體外 快速擴增特定基因或 DNA序列的方法。也是 體外 酶促合成 特異 DNA片段的方法。 經過 n輪 PCR擴增 循環(huán) ,理論上 可以得到 2n個新生的 DNA分子。 特別注意： ( 2). 一個 PCR體系的基本組成 ? 超純水 ? 緩沖液 ? Mg2+ ? dNTPs ? DNA模板 ? 引物 ? TaqDNA聚合酶 作業(yè) : ? 用 Sanger雙脫氧鏈終止法進行 DNA自動序列分析 (即 DNA測序分析 )的原理。 ? PCR技術原理。 ? 3 、轉化子的藍白篩選原理。 ? 原位雜交 (In Situ Hybridization， ISH)是用標記的核酸探針，經放射自顯影或非放射檢測體系，在組織、細胞、間期核及染色體上 對核酸進行定位和相對定量研究 的一種手段，分為 RNA原位雜交 ? 染色體原位雜交。 ? RNA原位雜交：用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）標記的特異性探針與被固定的組織切片反應，若細胞中存在與探針互補的 mRNA分子，兩者雜交產生雙鏈 RNA，可通過放射性標記或經酶促免疫顯色，對該基因的表達產物做出定性定量分析。 ? 基因芯片（ DNA chip），又稱 DNA微陣列（ DNA microarray）技術是能同時監(jiān)測大量靶基因表達的實驗手段，從而迅速準確地在基因組水平上闡述不同生物組織或細胞中各種轉錄本的變化規(guī)律。 一、原核生物基因表達調控總論 原核生物基因調控一般執(zhí)行如下規(guī)律 ? 一個體系需要時被打開，不需要時被關閉。 ? 基因的開與關是相對的。 ? 開 關的活性可以通過轉錄水平上進行調節(jié)。 基因表達調控主要表現(xiàn)在二個方面 ?轉錄水平上的調控 ?轉錄后水平上的調控 轉錄水平上的調控 ?負轉錄調控 （ negative trnscription regulation) 調節(jié)基因的產物是阻遏蛋白 ?正轉錄調控（ positive transcription regulation) 調節(jié)基因的產物是激活蛋白 負轉錄調控 ? 負控誘導 阻遏蛋白不與效應物結合時基因不轉錄。 ? 負控阻遏 阻遏蛋白與效應物結合時，基因不轉錄。 正轉錄調控 ? 正控誘導 有效應物時，激活蛋白處于活性狀態(tài)基因轉錄。 ? 正控阻遏 有效應物時，激活蛋白處于無活性狀態(tài)基因不轉錄。 負控誘導 負控阻遏 正控誘導 正控阻遏 弱化子 在操縱區(qū)與結構基因之間的一段可以 終止轉錄 作用的核苷酸序列，稱為弱化子。 B、弱化子對基因活性的影響 ? 有葡萄糖的存在即使在培養(yǎng)基中加入乳糖、半乳糖等誘導物，操縱子也不會啟動，這種現(xiàn)象稱為葡萄糖效應或稱為降解物抑制作用。 C、降解物對基因活性的調節(jié) ?當細菌生長過程中，氨基酸全面缺乏時，細菌將會產生應急反應，停止全部基因的表達。 ?產生應急反應的信號是鳥苷四磷酸 (ppGpp)和鳥苷五磷酸（ pppGpp），是由空載的 tRNA所引起的 。 D、細菌的應急反應 ?空載 tRNA會激活焦磷酸轉移酶，使 ppGpp大量合成， ppGpp的出現(xiàn)會關閉許多基因，PpGpp與 pppGpp的作用能夠影響一大批操縱子，所以稱他們是超級調控子或稱為魔斑。 環(huán)腺苷酸受體蛋白對轉錄的調控 ? cAMP 受 體 蛋 白 CRP （ cAMP receptor protein ） ， cAMP與 CRP結合后所形成的復合物稱激活蛋白 CAP（ cAMP activated protein ） 。 二、乳糖操縱子 ? 法國 Jacob和 Monod等人 1961年提出 (lac operon)學說 。 Jacob Monod 乳糖 (lac)操縱子的表達調控 阻遏蛋白的負性調控 ? 沒有乳糖時， 1ac操縱子處于阻遏狀態(tài)。 i 基因在自身的啟動子 Pi 控制下，產生阻遏蛋白 R。 R以四聚體形式與操縱子 o結合，阻礙 RNA聚合酶與啟動子 P的結合。 CAP的正性調控 ? cAMP含量與葡萄糖的分解代謝有關，當細菌利用葡萄糖供給能量時， cAMP含量降低；無葡萄糖時， cAMP含量升高。 ? cAMP與 CRP結合變?yōu)?CAP，并以二聚體的方式與特定的 DNA序列結合。 三、半乳糖（ gal)操縱子 ? 不同于 lac操縱子 ,沒有葡萄糖時可以被誘導 ,有葡萄糖存在時 gal也能被誘導，因此認為 gal中可能存在兩個啟動子。 (二 ) 弱化子及其作用 ?當色氨酸達到一定濃度，但還沒有高到能夠活化R使其起阻遏作用的程度時，產生色氨酸合成酶類的量已經明顯降低，而且產生的酶量與色氨酸濃度呈負相關。這種調控現(xiàn)象與色氨酸操縱子特殊的結構有關。 ?先導序列含有 3對反向重復序列，在被轉錄生成mRNA時都能夠形成發(fā)夾式結構，使轉錄終止。 ２、終止轉錄的作用（弱化機制） A. 當色氨酸濃度低時，生成的 tRNAtrp量就少，使核糖體沿 mRNA翻譯移動的速度慢，趕不上 RNA聚合酶沿 DNA移動轉錄的速度，這時核糖體占據(jù) 1位的機會較多，使 2不能配對， 3配對，阻止了 4生成終止信號的結構， trp操縱元處于開放狀態(tài)。 B. 當色氨酸濃度增高時，核糖體沿 mRNA翻譯移動的速度加快，占據(jù)到 2段的機會增加， 3配對的機會減少， 4形成終止結構的機會增多，轉錄減弱。 C. 當所有氨基酸都不足時，核糖體翻譯移動的速度就更慢，甚至不能占據(jù) 1的序列，結果有利于 2和 4發(fā)夾結構的形成，于是轉錄停止。等于告訴細菌：“整個氨基酸都不足，即使合成色氨酸也不能合成蛋白質，不如不合成以節(jié)省能量 ”。 原核與真核生物基因表達的差異 ? Repeptitive gene Overlapping gene ? Splitting gene no intron ? Posttranscription transcription amp。 translation RNA processing synchronizely Eukaryote Prokaryote ? DNA + histon →chromatin Naked DNA 回顧 原核生物與真核生物基因 表達調控機制具有驚人的相似性 共同的起源與共同的分子基礎 調控機理上 調控層次上 核酸分子間的互作 核酸與蛋白質分子間的互作 蛋白質分子間的互作 transcriptional level post— transcriptional lev