分子生物學(xué)技術(shù)(2)(編輯修改稿)
2025-02-09 07:55 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 探針越長擴(kuò)散速度越慢；復(fù)雜性越高，配對(duì)難度也增大。 ② 離子強(qiáng)度：高離子強(qiáng)度溶液中，有利于雜交分子形成。 影響核酸分子雜交的因素 ③ 溫度：通常在低于 Tm 2025℃ 的溫度下進(jìn)行雜交。 ④ 添加劑：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸可吸附 DNA探針，使 DNA接觸面增大，而加速雜交反應(yīng)。 ⑤ 雜交液中的甲酰胺。甲酰胺可降低核酸雜交的 Tm。含 30%— 50%甲酰胺的雜交溫度能降低到 30— 42℃ 。較低的雜交溫度，使探針更穩(wěn)定，并能更好地保留非共價(jià)結(jié)合的核酸。 預(yù)雜交 為了減少探針與廣泛存在的非互補(bǔ)核酸的非特異性結(jié)合，在雜交前可用封閉物將這些非特異位點(diǎn)封閉。在雜交前的這些處理過程稱為預(yù)雜交。 常用于預(yù)雜交的封閉物 ① 變性的非特異性 DNA：常用鮭魚精子 DNA或小牛胸腺 DNA。當(dāng)與濾膜一起孵育后，除濾膜上已吸附樣品 DNA的區(qū)域外，它們可被吸附到所有其它區(qū)域，使整個(gè)背景覆蓋一層。由于它們與探針無同源性，在雜交反應(yīng)中可大大減少探針的非特異性結(jié)合，使背影清晰。 ② 高分子化合物：某些高分子化合物具有封閉膜上非特異位點(diǎn)的能力。一般常用Denhard’t溶液，包含聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。 二、核酸探針 指能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知核酸片段。一般而言，核酸探針帶有特殊的標(biāo)記物。 核酸探針的類型： 寡核苷酸探針、基因組 DNA探針、 cDNA探針、 RNA探針、單鏈 DNA探針。 常用的探針標(biāo)記物： 放射性同位素（ 3H、 32P、 35S、 125I）；非放射性同位素（生物素、地高辛、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶等）。 三、核酸分子雜交信號(hào)的檢測(cè) ?放射性同位素標(biāo)記探針： 放射自顯影。 ?非放射性同位素標(biāo)記探針： 偶聯(lián)反應(yīng) +顯色反應(yīng)。 四、核酸分子雜交技術(shù) ?固相雜交：結(jié)合于某種固相支持物上的待測(cè)樣品與溶解于雜交液中的探針進(jìn)行的雜交。包括膜上印跡雜交、原位雜交。 ?液相雜交：待測(cè)樣品和探針均溶于液體中進(jìn)行雜交反應(yīng)。 （一）膜上印跡雜交 將待測(cè)核酸序列結(jié)合到一定的支持物上，然后與存在于液相中的核酸探針進(jìn)行雜交的過程稱為膜上印跡雜交。 印記的方法： 虹吸印跡法；真空轉(zhuǎn)移法；電轉(zhuǎn)移法 DNA或 RNA ↓ 電泳分離核酸片段 ↓ 轉(zhuǎn)移至固相支持物（印跡技術(shù)） ↓ 雜交 ↓ 洗去未雜交探針 ↓ 雜交信號(hào)檢測(cè) Northern 雜交 原理： RNA經(jīng)過變性瓊脂糖凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或尼龍膜上，經(jīng)過雜交，分析 mRNA的大小及含量。 應(yīng)用：半定量分析 mRNA的含量；確定mRNA分子的大小。 方法：提取組織細(xì)胞總 RNA→RNA 定量→ 變性膠電泳 → 轉(zhuǎn)膜 → 干膜 → 預(yù)雜交 →雜交 → 洗膜 → 壓片 → 洗片 → 圖像分析 Western印跡雜交 將待檢測(cè)蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng) PAGE電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體 抗原”免疫反應(yīng)或“ DNAprotein” 結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。 斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交 適于核酸樣品定量檢測(cè)。 （二）原位雜交 用標(biāo)記的已知核酸序列為探針，使其與細(xì)胞組織或切片中核酸進(jìn)行雜交檢測(cè)的方法稱為原位雜交。 原位雜交的類型： DNADNA、 DNARNA、RNARNA雜交。 取材 ↓ 組織、細(xì)胞固定 ↓ 預(yù)雜交 ↓ 雜交 ↓ 放射自顯影或免疫酶法顯色 ↓ 觀察結(jié)果 （三）液相雜交 1. RNA酶保護(hù)分析法 2. 核酸酶 S1保護(hù)分析法 待測(cè) RNA樣品 ↓ 液相雜交 ↓ DNARNA雜交雙
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