生化與分子生物學(xué)技術(shù)原理(編輯修改稿)
2025-02-12 10:44 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 Nt 產(chǎn)物 酸 Pu, Py, Pu, PyNt, 多聚核糖 P碎片 碎片 磷酸二酯鍵 嘧啶糖苷鍵 穩(wěn) 大 ? ? 定 ? 嘧啶糖苷鍵 磷酸二酯鍵 性 小 ? ? 嘌呤糖苷鍵 嘌呤糖苷鍵 2. β消除反應(yīng) 連接磷酸基團的 βC 原子上有強的吸電子基團存在時 , 引起 αC 原子和 O 原子間的鍵斷裂。 OH R– P– O– CH2– CH2– Z (–CHO, C=O , –HC=N ) O α β DNA and RNA 化學(xué)法測序 主鏈斷開 3. 堿基上反應(yīng) a. 烷基化反應(yīng) (CH3 ) 堿基上除 Pu N9 , Py N1外 ,所有 N和 O原子 均可因親電攻擊而甲基化。 ? 溫和 ( Soft ) 烷化劑 硫酸二甲酯 甲基硫烷 烷基化物 DMS MMS MeI Me N GN7 AN1 CN3 TN3 DMS作用于 dsDNA AN3(Me) , 阻止 DNA pol. ? 強 (Hard) 烷化劑 N甲基 N亞硝基脲 (MNU) N乙基 N亞硝基脲 (ENU) Me N , O 核酸 50% 磷酸酯烷化 烷化劑直接致癌 DMS GO6 : GN7 = : 1 MNU GO6 : GN7 = : 1 ( 肝 ) GO6 : GN7 = : 1 ( 腦 ) GN7(Me)不改變 G:C配對 GO6(Me)不影響 DNA pol,但改變堿基對 , G T b. 鹵化反應(yīng) 嘧啶 5 位 5FU 抗癌藥 鹵素分子 嘌呤 8 位 8BrPu 標記 c. 與醛類反應(yīng) 堿基的 環(huán)外 –NH2 AMP: N6NH2 GMP: N2NH2 甲醛是 DNA不可逆變性劑 ?鑒定 ssDNA or dsDNA ?破壞 RNA高級結(jié)構(gòu) ， 消除結(jié)構(gòu)對電泳遷移 率的影響 d. 核糖上的反應(yīng) ? 核糖的氧化反應(yīng) 核糖的 2’， 3’順二醇 被高碘酸 ( HIO4)氧化成 順二醛 ，胺催化 β 消除反應(yīng) ，同時堿基脫落 , 生成磷酸，堿基和糖碎片。 5’Nt 定量測定 RNA 序列測定 ? 核糖的脫水反應(yīng) 酸性條件下，核糖或脫氧核糖脫水產(chǎn)物與試劑反應(yīng)生成有色物質(zhì)?？捎枚ㄌ欠ū壬珳y定 DNA or RNA 含量。 ? 苔黑酚法測 RNA 核糖 糠醛 ? 二苯胺法測 DNA 脫氧核糖 ω 羥基 γ 酮基戊醛 3H2O 2H2O 六 . 核酸組分的分離鑒定 1. 分離 a. 電泳分離 Nt and dNt Nt (dNt ) 的解離及 pK值 ， Nts 間凈電荷 差異最大 . ADP質(zhì)子化狀態(tài) b. 層析 ? 離子交換層析 高效液相層析 ( HPLC ) ? 稀有成分纖維素薄板雙向?qū)游? 靈敏 , 快速 , 穩(wěn)定。 20種 3’ Nt, 22種 5’ Nt, 40種 Ns, 14種抗水 解 NmNp dimer. AmGp ~GmAp CmUp ~ UmCp 2. 鑒定 a. 標準品對照 (電泳 ,層析 ) UV吸收檢出 吸收 UV藍紫色斑點 , G藍色熒光 , D無吸收。 b. 紫外光譜鑒定 ? 溶液樣品在 220290nm 波長內(nèi)掃描 , 確定 λmax and λmin , 對照參數(shù) (特定 pH )。 例 : pH 67 λmax λmin A 260 227 G 253 223 C 271 250 U 262 230 T 267 236 ? 不同波長下吸收比值 A250/A260 A280/A260 A290/A260 注意點 : ? 一般 λ max 250280, λmin 220250 吸收曲線特征與 pH 相關(guān) , pH 1,7,12 下測定 。 ? Base 與 Ns 吸收值差異大 Ns~dNs~Nm Ns~Nt~dNt ? Gua類在酸性時 ,UV下蘭色熒光 ,光譜曲線有 肩。 ? 稀有成分的吸收光譜特征常不同于常見成分 第二章 核酸的分離純化 一 . 細胞中的核酸 1. 存在狀態(tài) 與蛋白質(zhì)結(jié)合 (除 tRNA ) 2. 分布 DNA : 原核 核質(zhì)區(qū) 真核 95%核內(nèi) 5%核外（ mt,ct ) RNA : 原核 胞質(zhì) 真核 90%質(zhì) (15%細胞器） 10%核 少 , 細胞干重 515%, 10ˉ15 10ˉ10 g / cell RNA 104106 Da DNA ＞ 106 Da
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