【正文】 可用定糖法比色測定 DNA or RNA 含量。 酮式 烯醇式 氨基 亞胺 N糖苷鍵 C1 與嘧啶 N1 連接 C1 與嘌呤 N9 連接 oligo 表示法 poly U 均聚物 poly (dAdT) 交替排列 poly (dA OH R– P– O– CH2– CH2– Z (–CHO, C=O , –HC=N ) O α β DNA and RNA 化學(xué)法測序 主鏈斷開 3. 堿基上反應(yīng) a. 烷基化反應(yīng) (CH3 ) 堿基上除 Pu N9 , Py N1外 ,所有 N和 O原子 均可因親電攻擊而甲基化。 b. 紫外光譜鑒定 ? 溶液樣品在 220290nm 波長內(nèi)掃描 , 確定 λmax and λmin , 對照參數(shù) (特定 pH )。 構(gòu)型的改變涉及到共價(jià)鍵破壞 核酸中核糖僅一種構(gòu)型 ： β D型 構(gòu)象 (conformation) 化合物內(nèi)可以自由轉(zhuǎn)動(dòng)的單鍵上的原子或基團(tuán) ,繞單鍵旋轉(zhuǎn)或隨單鍵扭轉(zhuǎn) ,產(chǎn)生幾種不同的空間排列形式。 下一代配子保持相同格式 Igf2 gene IGFⅡ 胰島素 like生長 因子依賴于父本表達(dá) Igf2R gene IGFⅡR 胰島素 like生長 因子受體依賴于母本表達(dá) 一條 X染色體的失活 ? 甲基化格式的建立、維持和改變 從無到有 (de novo)甲基化 雙鏈相對 CpG mCpG 確立新格式 甲基化的維持 脫甲基 被動(dòng) 復(fù)制后不再甲基化 主動(dòng) 甲基轉(zhuǎn)移 堿基切除修復(fù) ? CpGrich islands 基因組中存在異常非甲基化 CpG順序簇 高含量 C+G 高頻率 CG dimer (10/100bp ) 分布不均 , 長 12 kb， 間隔 ~100 kb 非甲基化 –CpG 存在 ： housekeeping genes tissues specific genes 5’ 啟動(dòng)子 ——轉(zhuǎn)錄區(qū) 腺嘌呤磷酸核糖 轉(zhuǎn)移酶 CpG密度 1/100bp CpG密度 10/100bp –100 ~ 300 1. 二氫葉酸還原酶基因 2. 次黃嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖酶基因 3. 核糖體蛋白質(zhì)基因 1 2 3 CG mCG 抑制轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì) MeCP1 *CpG 成簇 MeCP2 *CpG DNA甲基化有助于基因關(guān)閉 五 . 核酸及其化學(xué)組分的化學(xué)反應(yīng) 磷酸二酯鍵 , 磷酸單酯鍵 , N糖苷鍵 a. 酶水解 b. 酸堿水解 ? 磷酸二酯鍵 ? 酸 熱強(qiáng)酸 dA,dG 30mi （ 100176。 ? 稀有成分的吸收光譜特征常不同于常見成分 第二章 核酸的分離純化 一 . 細(xì)胞中的核酸 1. 存在狀態(tài) 與蛋白質(zhì)結(jié)合 (除 tRNA ) 2. 分布 DNA : 原核 核質(zhì)區(qū) 真核 95%核內(nèi) 5%核外（ mt,ct ) RNA : 原核 胞質(zhì) 真核 90%質(zhì) (15%細(xì)胞器） 10%核 少 , 細(xì)胞干重 515%, 10ˉ15 10ˉ10 g / cell RNA 104106 Da DNA ＞ 106 Da 二 .制備中注意事項(xiàng) 保持生物學(xué)功能 ,具有生物活性 分子完整 ,天然狀態(tài) (未變性 ) 04℃ pH 59 （ shearing ) 5. 防止核酸酶降解作用 a. DNase 活性需要 Me2+( Mg 2+, Ca2+, Mn2+…… ) 螯合劑 ? SSC 檸檬酸三鈉 NaCl ? EDTANa2 乙二胺四乙酸鈉 ( Me2+) ? EGTA 乙二醇二氨基乙醚四乙酸 (Ca2+ 特異性 ) b. RNase 活性不需 Me2+，熱穩(wěn)定，回復(fù)能力強(qiáng) . ● 防止外源 RNase污染 污染源：器皿、溶液、操作者． 措施 ? 180℃ 高溫處理數(shù)小時(shí) ? % DEPC（二乙基焦碳酸鹽 )處理 O O 蛋白變性劑 C2H5–O–C–O–C–O–C2H5 共價(jià)修飾 RNase ? 操作者 ● 抑制內(nèi)源 RNase 盡早、徹底去蛋白 ? 非專一性吸附劑 RNase 堿性蛋白（ pI ） ,中性 pH下 靜電吸附． 皂土、復(fù)合硅酸鹽（ Macaloid）、多聚陰 離子（肝素、聚乙烯硫酸酯）． ? 蛋白變性劑 異硫氰酸胍、 SDS （十二烷基硫酸鈉） 破細(xì)胞同時(shí)使 RNase 失活 ? RNase 抑制劑 RNasin 465aa 酸性蛋白（鼠肝、人胎盤） 與 RNase結(jié)合，保護(hù) RNA, 不用于提?。? ? 核苷酸底物類似物 –—競爭性抑制劑 ApUp RNaseA G2’5’G RNaseT1 三 . 核酸的分離提取 總核酸 目的核酸 細(xì)胞器 目的核酸 ? 物理法 石英沙研磨、超聲、勻漿、搗碎器． ? 化學(xué)法 去污劑、蛋白變性劑破膜 ? 生化法 溶菌酶、蛋白酶 動(dòng)、植物材料 液 N2, 機(jī)械破碎 細(xì)菌 溶菌酶水解肽聚糖破壁 培養(yǎng)細(xì)胞 去污劑與蛋白酶破膜 破膜用去污劑 ? SDS C12H25OSO3 Na＋ % 終濃度 [Na+] ≧1 M SDS↓ 影響 CsCl 梯度 ? Sarkosyl（十二烷基肌氨酸鈉） 3% 終濃度 ? 異硫氰酸胍 ? 非離子型去污劑 TritonX100、 Brij58 作用溫和、膜部 分破