生化與分子生物學(xué)技術(shù)原理(文件)
【正文】 Py 堿基三字符號 Ade Cyt Gua Thy Ura Ns單字符號 (d) A C G T U Ns, Nt, oligoNts 中均為 D戊糖 堿基可異構(gòu)化 異構(gòu)平衡僅 H 原子位置變化 UV,NMR分析 生理 pH 條件下 , 5種堿基 % 以氨基與酮式存在 。 構(gòu)型的改變涉及到共價鍵破壞 核酸中核糖僅一種構(gòu)型 ： β D型 構(gòu)象 (conformation) 化合物內(nèi)可以自由轉(zhuǎn)動的單鍵上的原子或基團(tuán) ,繞單鍵旋轉(zhuǎn)或隨單鍵扭轉(zhuǎn) ,產(chǎn)生幾種不同的空間排列形式。 扭轉(zhuǎn)角決定核苷的構(gòu)象 ? 存在 溶液 : 順反式可互換 結(jié)晶 : 順反式不可互換 C2’endo C3’endo 四 . 核酸的修飾成分及甲基化 1948年 小牛胸腺 DNA分離 m5dC 特點(diǎn) : ? 原有成分的衍生物 ? 含量少 (百分之幾 ~萬分之幾 ) ? 主要化學(xué)鍵不變 60余種 Ura Ade Gua Cyt Thy 25 17 12 6 2 ? 堿基上原子被其他基團(tuán)取代 m p om …… ? AA衍生物 BaseCONHAA ? 糖衍生物 BaseCH2OH糖 (6C) ? 非嘌呤 ,嘧啶衍生物 ( tRNA ) W 異丙烯 Gua tRNA anticodon 3’鄰位 Q 7去 NGua tRNA anticodon 擺動位 RNA C2’OH 甲基化 ( Nm ) 抗水解 (Rnase ,[ OH175。 C) rA,rG 1M HCl 60min rC, rU 12M HClO4 60min ? 堿 DNA 不作用 RNA 鄰接基團(tuán)參與效應(yīng) ,生成磷酸 基轉(zhuǎn)移中間物 ,水解。 5’Nt 定量測定 RNA 序列測定 ? 核糖的脫水反應(yīng) 酸性條件下，核糖或脫氧核糖脫水產(chǎn)物與試劑反應(yīng)生成有色物質(zhì)。 b. 紫外光譜鑒定 ? 溶液樣品在 220290nm 波長內(nèi)掃描 , 確定 λmax and λmin , 對照參數(shù) (特定 pH )。Cs2SO4 ρ DNA= ? pH 不同 ,堿基結(jié)合 Cs﹢ 量不同 ,ρ 值不同 . 沉降速度超離心 沉降平衡超離心 原理 沉降速度不同 浮密度不同 梯度物質(zhì) 蔗糖 070% CsCl 密度 密度 ﹤NA 密度 包含ρ 離心力場 強(qiáng) 56萬 rpm 稍強(qiáng) 35萬 rpm NA↓ CsCl 成梯度 分子運(yùn)動 向管底 5S 小 ↑ or↓ 于等密度處 16S rRNA ↓ (ds,ss,cc,oc,l 23S 大 DNA RNA ) 離心時間 較短 免于 ↓ 管底 長 12 天 時間過長 失敗 不變 操作 制備梯度 → 鋪樣 → 離 CsCl+樣品 → 混勻 心 → 收集 → 離心 → 收集 應(yīng)用 RNA,ssDNA,限制性 DNA 酶切片段 ? 測 ρ ? 測 (G + C)% ρ = + (G + C)% 天然、線狀、 ds DNA , 修飾少 . (G + C)% ~ 20 – 80% ? RNA , DNA 和蛋白質(zhì)的分離 中性 CsCl ρRNA , ρDNA , ρ蛋白 ρ: RNA RNA ? Base 與 Ns 吸收值差異大 Ns~dNs~Nm Ns~Nt~dNt ? Gua類在酸性時 ,UV下蘭色熒光 ,光譜曲線有 肩。 ? 苔黑酚法測 RNA 核糖 糠醛 ? 二苯胺法測 DNA 脫氧核糖 ω 羥基 γ 酮基戊醛 3H2O 2H2O 六 . 核酸組分的分離鑒定 1. 分離 a. 電泳分離 Nt and dNt Nt (dNt ) 的解離及 pK值 ， Nts 間凈電荷 差異最大 . ADP質(zhì)子化狀態(tài) b. 層析 ? 離子交換層析 高效液相層析 ( HPLC ) ? 稀有成分纖維素薄板雙向?qū)游? 靈敏 , 快速 , 穩(wěn)定。 OH R– P– O– CH2– CH2– Z (–CHO, C=O , –HC=N ) O α β DNA and RNA 化學(xué)法測序 主鏈斷開 3. 堿基上反應(yīng) a. 烷基化反應(yīng) (CH3 ) 堿基上除 Pu N9 , Py N1外 ,所有 N和 O原子 均可因親電攻擊而甲基化。其區(qū)別使父母等位基因在胚胎中表達(dá)不同。 ? 內(nèi)式構(gòu)象 (endo)偏離平面的方向和 C5’同向 ? 外式構(gòu)象 (exo) 偏離平面的方向和 C5’反向 1. 信封式 (Envelope, E ) 糖環(huán)的 C 2’或 C 3’ 1個原子偏離平面的折疊 C2’endo ( 2E ) C3’endo ( 3E ) C2’exo ( E2 ) C3’exo ( E3 ) 內(nèi)式 外式 側(cè)視圖 2. 扭轉(zhuǎn)式 ( Twist, T ) 糖環(huán)的 C2’ 和 C3’ 兩個原子都偏離糖平面 ,而且取方向相反的折疊。dT) 隨機(jī)排列 poly A 酮式 烯醇式 氨基 亞胺 N糖苷鍵 C1 與嘧啶 N1 連接 C1 與嘌呤 N9 連接
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