【正文】 ? 稀有成分的吸收光譜特征常不同于常見成分 第二章 核酸的分離純化 一 . 細胞中的核酸 1. 存在狀態(tài) 與蛋白質結合 (除 tRNA ) 2. 分布 DNA : 原核 核質區(qū) 真核 95%核內(nèi) 5%核外（ mt,ct ) RNA : 原核 胞質 真核 90%質 (15%細胞器） 10%核 少 , 細胞干重 515%, 10ˉ15 10ˉ10 g / cell RNA 104106 Da DNA ＞ 106 Da 二 .制備中注意事項 保持生物學功能 ,具有生物活性 分子完整 ,天然狀態(tài) (未變性 ) 04℃ pH 59 （ shearing ) 5. 防止核酸酶降解作用 a. DNase 活性需要 Me2+( Mg 2+, Ca2+, Mn2+…… ) 螯合劑 ? SSC 檸檬酸三鈉 NaCl ? EDTANa2 乙二胺四乙酸鈉 ( Me2+) ? EGTA 乙二醇二氨基乙醚四乙酸 (Ca2+ 特異性 ) b. RNase 活性不需 Me2+，熱穩(wěn)定，回復能力強 . ● 防止外源 RNase污染 污染源：器皿、溶液、操作者． 措施 ? 180℃ 高溫處理數(shù)小時 ? % DEPC（二乙基焦碳酸鹽 )處理 O O 蛋白變性劑 C2H5–O–C–O–C–O–C2H5 共價修飾 RNase ? 操作者 ● 抑制內(nèi)源 RNase 盡早、徹底去蛋白 ? 非專一性吸附劑 RNase 堿性蛋白（ pI ） ,中性 pH下 靜電吸附． 皂土、復合硅酸鹽（ Macaloid）、多聚陰 離子（肝素、聚乙烯硫酸酯）． ? 蛋白變性劑 異硫氰酸胍、 SDS （十二烷基硫酸鈉） 破細胞同時使 RNase 失活 ? RNase 抑制劑 RNasin 465aa 酸性蛋白（鼠肝、人胎盤） 與 RNase結合，保護 RNA, 不用于提?。? ? 核苷酸底物類似物 –—競爭性抑制劑 ApUp RNaseA G2’5’G RNaseT1 三 . 核酸的分離提取 總核酸 目的核酸 細胞器 目的核酸 ? 物理法 石英沙研磨、超聲、勻漿、搗碎器． ? 化學法 去污劑、蛋白變性劑破膜 ? 生化法 溶菌酶、蛋白酶 動、植物材料 液 N2, 機械破碎 細菌 溶菌酶水解肽聚糖破壁 培養(yǎng)細胞 去污劑與蛋白酶破膜 破膜用去污劑 ? SDS C12H25OSO3 Na＋ % 終濃度 [Na+] ≧1 M SDS↓ 影響 CsCl 梯度 ? Sarkosyl（十二烷基肌氨酸鈉） 3% 終濃度 ? 異硫氰酸胍 ? 非離子型去污劑 TritonX100、 Brij58 作用溫和、膜部 分破 2．解聚核蛋白并除蛋白 核酸 pI SDS結合蛋白質 濃 KAc + SDS → SDS K ↓ b．有機溶劑 酚、氯仿 蛋白質變性劑 酚、酚／氯仿－異戊醇、氯仿－異戊醇 注意：防剪切力（振蕩速度、大口吸管）， 處理酚（重蒸、緩沖液飽和、 % 8羥基喹啉） c． Proteinase K 處理 廣譜 ,水解力強 ,可在 SDS,EDTA存在下作用． 3．核酸的沉淀 a．乙醇 核酸的 Na, K 鹽在乙醇中 ↓ ? 調節(jié)鹽濃度： NaCl, NaAc, NH4Ac ? 加 冷乙醇（ ﹥ 95%） 攪出 DNA 或離心 ↓ ? 7075% 乙醇洗滌去鹽 除盡 EtOH,干燥 ? 溶于 TE (10mM TrisHCl pH ,1m MEDTA) ? 核酸濃度 ﹤ , 加助沉淀劑 ? 重復沉淀， 補鹽 ! b．異丙醇 M NaAc, 選擇性沉淀 DNA and 大 RNA, 體積小，不需 低溫放置． 沸點高，鹽 ↓ ，須 EtOH 洗滌． 4. 雜質的去除 a. 小分子雜質 b. 多糖 ? 樣品預處理 動物 饑餓 植物 暗化 ? 選擇性沉淀 ? 異丙醇 糖與小分子 RNA不 ↓ ? CTAB（十六烷基三甲基溴化銨） CH3 | CH3(CH3)15–N+–CH3 + NA– / \ CH3 CH3 CTANA ? NaNA ? (EtOH) + CTAAc（溶） Br NaAc 70% EtOH 1% NaCl 多糖溶解 c. RNA與 DNA 互為雜質 DNP 溶于 12M NaCl RNP 溶于 NaCl ? 除 RNA RNase( 100℃,15min 處理 ,除 DNase) ? 除 DNA RNasefree DNase 5. 保存 防止降解、變性 措施：滅菌、低溫、鹽濃度、 pH、 EDTA…… DNA TE buffer,4 –20℃, 70 % EtOH RNA 冰凍干燥、低溫 6. 純度的初步鑒定 a. UV吸收曲線 b. UV吸收比值 DNA A260/A280 = RNA A260/A280 = 核酸的含量測定 (260nm,1cm 光徑 ) 1 A260 50μg/ml dsDNA 40μg/ml ssDNA, RNA 36μg/ml oligo Nts c. 膠電泳 定量 , 定性 四 .