【正文】 由α互補(bǔ)產(chǎn)生的Lac+ 細(xì)菌較易識(shí)別，它在生色底物Xgal(5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代βD半乳糖苷)誘導(dǎo)形成藍(lán)色菌落。E. coli DH5α菌株帶有β半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。而只帶有自身環(huán)化的外源片段的轉(zhuǎn)化子則不能存活。凹端,使不相匹配的末端轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)末端或轉(zhuǎn)為平末端后再進(jìn)行連接。 　　帶有平末端 是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA聚合酶補(bǔ)平所致。還可將載體DNA的539。也可在PCR擴(kuò)增時(shí)，在DNA片段兩端人為加上不同酶切位點(diǎn)以便與載體相連。在質(zhì)粒載體上進(jìn)行克隆,從原理上說是很簡單的，先用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA和目的DNA片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌,即可完成。　?。ǘ┑诙満铣?　　第二鏈合成可在第一鏈合成反應(yīng)液中直接進(jìn)行。 　?。?）取出置冰上。 　　操作步驟： 　?。?）取一滅菌的無RNA酶的eppendorf管加入的RNA樣品，及引物或引物延接頭，（ NotⅠ引物延接頭/mg mRNA）的體積至15ml，70℃加熱5分鐘，待冷至室溫，離心數(shù)秒鐘使溶液集中在管底，然后依次加入： 　　　　5第一鏈緩沖液 5ml 　　　　rRNasinR RNA酶抑制劑 25ml 　　　　 　　　　AMV反轉(zhuǎn)錄酶 15m/mg RNA 　　　　加無水RNA酶水至總體積25ml 　　在加入焦碳酸鈉和AMV反轉(zhuǎn)錄酶前，需將反應(yīng)液42℃溫浴5分鐘，以阻止焦碳酸鈉沉淀。 　　2m RNaseH 　　500m PolymeraseⅠ 　　100m T4 DNA PolymeraseⅠ 　　 不含核酸酶的水 　　以上所有試劑除對照RNA需在70℃保存外，其余均可保存于20℃，可以合成40mgmRNA。 900mmol/L KCl。 50mmol/L DTT。Cl,(42℃)。 　　(3) 加樣,電泳到染料距前沿線只剩膠長度的1/3處，電泳緩沖液為30mmol/L NaOH, 1mmol/L EDTA。將第一鏈和第二鏈摻入測定管中的反應(yīng)液先用酚抽提,乙醇沉淀，方法見本章（二）第二鏈合成中的912步，一般第一鏈和第二鏈上樣量相同。 　　(4) 分別測定總放射性活性強(qiáng)度和摻入放射性活性強(qiáng)度,可用蓋革計(jì)算器,也可用液閃計(jì)數(shù)?！　。ㄈ┩凰?fù)饺敕派湫曰钚詼y定、計(jì)算和電泳分析 　　1. 試劑 　　1mg/ml鮭魚精DNA， 三氯乙酸(TCA, 5%和7%)，堿性瓊脂糖膠，堿性膠電泳緩沖液，（ 30mM NaOH，1mM EDTA），2樣品緩沖液，（20mM NaOH，20% 甘油，%溴酚藍(lán)）?！　∷嘁浦亮硪籩ppendorf管,(,), (20℃), 20℃放置30分鐘后離心5分鐘。 　　 cDNA第二鏈合成離心管反應(yīng)液70℃處理10分鐘, 低速離心后置冰上。 　　(6) 第一鏈合成eppendorf管可直接用于第二鏈合成 　　注：以上25μl反應(yīng)總體積中所用RNA量為1μg,如合成5μg RNA,則可按比例擴(kuò)大反應(yīng)體積, 倒5μg RNA使用125μl總體積進(jìn)行合成。（一） 第一鏈合成 　　1. 試劑 　　[α32 P] dCTP (400Ci/mmol)，EDTA (50mM和200mM)，TE飽和酚:氯仿（1:1）， NH4Ac，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液。 44mmol/L MgCl2。 50mmol/L DTT。該系統(tǒng)試劑包括：　　20μg 特異性引物 　　200μl MMLV第一鏈緩沖液(5)，配方如下: 250mmol/L Tris 　　[注意] 整個(gè)操作應(yīng)盡可能在低溫下進(jìn)行。　　取水相，加入1/10倍體積的3mol/L NaAc()，混勻，20℃30分鐘。 　　三、試劑 　　TE飽和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc()，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液，無RNA酶的雙菌水。每次用前需用NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床?！　⌒⌒臈壢ド锨逡海恋砜諝飧稍?0分鐘，或真空干燥10分鐘。　　測定每一管的OD260，當(dāng)洗出液中OD為0時(shí)，加入23倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。 　　(dT)纖維素。RNA可進(jìn)行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于70℃。 　　取上層水相于一新的離心管，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。Cl()，1mmol/L EDTA()，% SDS。 　　二、設(shè)備 　　研缽，冷凍臺(tái)式高速離心機(jī)，低溫冰箱，冷凍真空干燥器，紫外檢測儀，電泳儀，電泳槽。克隆的常用方法有：（1）平端連接法，須先用Klenow酶或T4DNA聚合酶將雙鏈cDNA兩端填平補(bǔ)齊，之后以平末端與載體DNA連接，平端連接效率較低；（2）cDNA兩端加接頭或銜接物，接頭需用限制酶水解，因此加接頭前cDNA應(yīng)先用相應(yīng)的甲基化酶使其甲基化，以保護(hù)cDNA不被消化。 （3）隨機(jī)引物法：用六核苷酸在DNA鏈上隨機(jī)引發(fā)合成第二條鏈 （4）均聚物引發(fā)法 用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，加入一種dNTP,ZAI cDNA第一條鏈3’端加上那個(gè)均聚物尾巴，然后用配對的寡聚物作為引物合成第二條鏈； （5）如果序列是已知的，也可以用特異引物來合成第二條鏈。該反應(yīng)有3個(gè)主要優(yōu)點(diǎn): (1) 非常有效。但自身引導(dǎo)合成法較難控制反應(yīng)，而且用S1核酸酶切割發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)無一例外地將導(dǎo)致對應(yīng)于mRNA 539。端poly(A)結(jié)合的1218核苷酸長的oligo(dT)。MLV反轉(zhuǎn)錄酶能合成較長的cDNA(如大于23kb)。 　　二、cDNA第一鏈的合成　　所有合成cDNA第一鏈的方法都要用依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)來催化反應(yīng)。分離的總RNA可利用mRNA 339。除DEPC外,也可用異硫氰酸胍、釩氧核苷酸復(fù)合物、RNA酶抑制蛋白等。試驗(yàn)所用試劑也可用DEPC處理,%濃度,然后劇烈振蕩10分鐘,再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小時(shí)以上。cDNA合成及克隆的基本步驟包括用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈,聚合酶合成cDNA第二鏈,加入合成接頭以及將雙鏈DNA克隆到于適當(dāng)載體(噬菌體或質(zhì)粒)。 第四章 RNA的提取和cDNA合成第一節(jié) 概 述 　　從真核生物的組織或細(xì)胞中提取mRNA,通過酶促反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈,將雙鏈cDNA和載體連接,然后轉(zhuǎn)化擴(kuò)增, 即可獲得cDNA文庫,構(gòu)建的cDNA文庫可用于真核生物基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)和調(diào)控的分析。 　　四、 計(jì)算轉(zhuǎn)化率 　　統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。 　　將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時(shí),待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37℃培養(yǎng)1624小時(shí)。 　　三、 轉(zhuǎn)化 　　從70℃冰箱中取200μl感受態(tài)細(xì)胞懸液,室溫下使其解凍,解凍后立即置冰上。 　　二、 感受態(tài)細(xì)胞的制備 ( CaCl2 法) 　　將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10分鐘,然后于4℃下3000g離心10分鐘。 　　: CaCl2(無水,分析純),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌。 　　三. 試劑 　?。号浞揭姷谝徽隆Ｄ茉贏mp培養(yǎng)基上生長的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了pBS。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。 　　 DH5a菌株為受體細(xì)胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態(tài),然后與pBS質(zhì)粒共保溫,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。1ng的cccDNA即可使50μl （ng=109）的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。DH5α菌株的OD600 ,細(xì)胞密度在5107 個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時(shí)比較合適。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant,即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞)?！　∞D(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10之下，否則，酶活性將受影響。 　　[注意] ，否則DNA溶液中其他成分會(huì)干擾酶反應(yīng)。 　　 DNA酶切片段大小的測定：在放大的電泳照片上,用卡尺量出DNA樣品各片段的遷移距離,根據(jù)此數(shù)值,在DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的對數(shù)值,進(jìn)一步計(jì)算出各片段的分子量大小(若用單對數(shù)坐標(biāo)紙來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,則可根據(jù)遷移距離直接查出DNA片段的大小)。紫光燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩,以免損傷眼睛。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí),停止電泳。若DNA含量偏低,則可依上述比例增加上樣量,但總體積不可超過樣品槽容量。倒膠時(shí)的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現(xiàn)氣泡。 　　 膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。 　　三、 瓊脂糖凝膠的制備 　　 取5TBE緩沖液20ml加水至200ml,TBE稀釋緩沖液,待用。 　　二、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的制備 　　采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段來作為電泳時(shí)的分子量標(biāo)準(zhǔn)。此步操作是整個(gè)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵,要防止錯(cuò)加，漏加。 　　三、 試劑 　　 5TBE電泳緩沖液：配方見第一章。 EcoRI酶及其酶切緩沖液: 購買成品。在沒有離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率最小,DNA幾乎不移動(dòng),在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10電泳緩沖液),則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。但是隨著電場強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。 　　 DNA分子的構(gòu)象 　　當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。 　　 瓊脂糖濃度　　一個(gè)給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進(jìn)行電泳。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。該技術(shù)操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)最適條件各不相同,各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和最適反應(yīng)溫度(大多數(shù)為37℃)。 　　構(gòu)建DNA限制性內(nèi)切酶圖譜有許多方法。若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用,隨后調(diào)節(jié)鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。…CTTAA↑G …539?！璆↓AATTC…339。CCC↓GGG339。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識(shí)別長度為4至6個(gè)核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識(shí)別六個(gè)核苷酸序列:539。Ⅰ類酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅲ類酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA分子,然后從底物上解離。 　　[注意] 在裝柱過程中,要防止柱床中出現(xiàn)斷裂或氣泡現(xiàn)象,要使界面保持平整。 　　合并所有含質(zhì)粒的洗脫液,用等體積的酚/氯仿(1:1)抽提,4℃下12000g離心2分鐘,將上層水相轉(zhuǎn)入新管。 　　% SDS的TE()貯液瓶。當(dāng)有些試驗(yàn)需無RNA污染的DNA制品時(shí),則需進(jìn)行進(jìn)一步純化。　　1 6570℃預(yù)熱過的滅菌重蒸水或TE,1分鐘后2500rpm(1300g)離心柱子/離心管5分鐘。 　　1真空抽干所加入的洗脫。 　　 加10ml Wizard大量DNA純化樹脂溶液, 并渦旋混合。 　　 小心地將上清液吸出并移至一個(gè)新離心管中。 　　100500ml細(xì)胞培養(yǎng)液置離心管中, 2225℃下5000g離心10分鐘, 所得細(xì)胞沉淀充分懸浮于細(xì)胞懸浮液中。 　　3. 由于RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐熱的特性,使用時(shí)應(yīng)先對該酶液進(jìn)行熱處理(80℃ 1小時(shí)),使DNA酶失活。 　　14℃下12000g離心15分鐘, 沉淀用數(shù)ml 70%冰冷乙醇洗滌，4℃下12000g離心5分鐘。 　　取上清液,加入50ml RNA酶A(10mg/ml), 37℃水浴20分鐘。 　　將細(xì)菌沉淀物重新懸浮于5ml溶液I中,充分懸浮菌體細(xì)胞。大量提取的質(zhì)粒DNA一般需進(jìn)一步純化,常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。 　　將微型柱放在一個(gè)新eppendorf管中，加50μl TE(或水)于微型柱中，靜止1分鐘后，4℃下12000g離心20秒。 　　加1ml Wizard少量 DNA 純化樹脂,顛倒離心管數(shù)次以充分混勻。 　　去除上清液，菌體細(xì)胞懸浮于200μl 細(xì)胞懸浮液中,充分混合,并移入eppendorf管中。 　?。ㄈ?、Wizard少量 DNA 純化系統(tǒng) 　　Promega公司的Wizard少量DNA純化系統(tǒng)可快速有效的抽提質(zhì)粒DNA,整個(gè)過程只需15分鐘?！　注意] 1. 提取過程應(yīng)盡量保持低溫。 　　將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后置于20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。 　　菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩),室溫下放置510分鐘。有時(shí)不同溶菌酶也能溶菌?！　∮脽o菌牙簽從eppendorf管中去除細(xì)菌碎片。 　　將菌體沉淀懸浮于120ml STET溶液中, 渦旋混勻。 　　二、 質(zhì)粒DNA少量快速提取 　　質(zhì)粒DNA小量提取法對于從大量轉(zhuǎn)化子中制備少量部分純