【正文】 這樣蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而是取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。等電聚焦電泳的原理 在聚丙烯酰胺凝膠中加入兩性電解質(zhì)載體,使其在電場中形成一個(gè)連續(xù)且穩(wěn)定的線性或非線性的pH梯度,使pH從凝膠的正極向負(fù)極依次遞增,電泳時(shí)被分離的蛋白質(zhì)在偏離等電點(diǎn)的pH位置時(shí)，因帶有電荷而移動(dòng),. 二向：SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 原理: 蛋白質(zhì)在電泳時(shí)，它的遷移率取決于它所帶靜電荷的多少以及分子的大小和形狀等因素。后基因組學(xué)主要利用DNA微列陣技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)、酵母菌雙雜交系統(tǒng)以及生物信息學(xué)等技術(shù)相結(jié)合，對(duì)已知的基因組序列進(jìn)行研究第十七章 蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組是指一個(gè)基因組、一種生物、一種細(xì)胞或組織所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)。帶電粒子在毛細(xì)管內(nèi)電解質(zhì)溶液中的遷移速度等于電泳和電滲流(EOF)二者的矢量和。因此,小分子向前移動(dòng)的速度比大分子快。序列圖譜（sequence map）是人類基因組的全部核苷酸的排列順序。即通過計(jì)算遺傳標(biāo)記的重組率，以重組率的大小反映遺傳標(biāo)志間的相對(duì)距離繪制遺傳圖譜（1厘摩表示重組率為1％）。 RNAi具有一定的可遺傳性。siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA， 可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNAdependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級(jí)siRNA，從而使RNAi的作用進(jìn)一步放大，最終將靶mRNA完全降解。 發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS), 是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的一種現(xiàn)象。 核酶： 具有酶活性的RNA，參與RNA的加工和成熟。（一）反義（antisense）技術(shù) 反義RNA：指根據(jù)RNA序列人工合成的互補(bǔ)RNA。將制得的四組混合物全部平行地點(diǎn)加在變性聚丙烯酸受凝膠電泳板上進(jìn)行電泳，每組制品中的各個(gè)組分將按其鏈長的不同得到分離，根據(jù)放射自顯影圖譜，從不同的分組和電泳條帶的順序，可以直接讀出待測(cè)DNA片段的核苷酸序列。2. 酶切分析：根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶切、獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，還能進(jìn)行變異性研究。PCR反應(yīng)條件: (1)．變性溫度與時(shí)間： 94℃ 3060 sec；(2)．退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間： 40℃～60℃ 30～60sec；(3)．延伸溫度與時(shí)間：常用溫度為72℃；(4)．循環(huán)次數(shù): 25～40次。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 基本原理：PCR技術(shù)實(shí)際上是在模板DNA，引物，和4種脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。多用于克隆篩選和點(diǎn)突變分析。RNA探針：RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高,特異性強(qiáng)。 核酸探針：是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記而便于檢測(cè)的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知DNA或RNA片段。分子雜交技術(shù)雜交（hydridization）指兩個(gè)以上的分子因具有相近的化學(xué)性質(zhì)(或結(jié)構(gòu)互補(bǔ))而在適宜的條件下特異地相互識(shí)別、結(jié)合形成雜交體（hybrid）的過程。遷移率：即單位電場強(qiáng)度粒子在電場中運(yùn)動(dòng)的速度，取決于帶電粒子的電荷量、粒子大小和形狀。 電泳過程中由于通電產(chǎn)生焦耳熱，熱對(duì)電泳有很大的影響。 2 .溶液的pH值溶液的pH值決定了帶電顆粒解離的程度，決定了物質(zhì)所帶凈電荷的量和性質(zhì)。影響電泳速度的因素：(一)顆粒自身因素 遷移率與顆粒表面電荷成正比，與介質(zhì)粘度及顆粒半徑成反比。4基因免疫治療 通過將抗癌免疫增強(qiáng)細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤組織，以增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應(yīng)。 2個(gè)步驟：（1）長雙鏈RNA被細(xì)胞源性的雙鏈RNA特異的核酸酶(Dicer)切成2123個(gè)堿基對(duì)的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（small interfering RNA）（2）小干擾性RNA與細(xì)胞源性的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNAinduced silencing plex,RISC），該復(fù)合體可識(shí)別與小干擾性RNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點(diǎn)將該mRNA切斷 3 自殺基因治療:惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達(dá)。這種反義RNA能與mRNA分子特異性地互補(bǔ)結(jié)合形成二聚體,從而阻止靶核酸的表達(dá)。如血友病?；蚯贸夹g(shù)（gene knockout)是指通過基因同源重組的過程定向的在活細(xì)胞中從基因組上移出特定基因的過程，從而建立基因剔除細(xì)胞和基因剔除生物。 指紋圖譜法: ,因此電泳后在用標(biāo)記的小衛(wèi)星DNA做探針雜交時(shí),不同個(gè)體出現(xiàn)不同的雜交帶型, ．高度的特異性 2 ． 穩(wěn)定的遺傳性： DNA 是人的遺傳物質(zhì)，其特征是由父母遺傳的。在探針分子完整的情況下， R 發(fā)出的熒光被 Q 淬滅吸收。Southern blot 檢測(cè)鐮狀細(xì)胞貧血，制備血液DNA MstII消化 瓊脂糖電泳 轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜 與標(biāo)記的珠蛋白DNA雜交 放射自顯影；PCR擴(kuò)增檢測(cè) PCR擴(kuò)增珠蛋白基因 MstII消化 瓊脂糖電泳 EB染色例2：β地中海性貧血基因診斷（PCRASO）點(diǎn)突變，無限制性酶切位點(diǎn)改變，采用PCR結(jié)合等位基因特異性寡核苷酸探針雜交技術(shù) 已知突變Gene部位和性質(zhì)，合成寡核苷酸探針，32P標(biāo)記，進(jìn)行Southern Blot 雜交/斑點(diǎn)雜交。具體地說就是將已知DNA片段或cDNA片段作為探針，緊密有序地排列固定于支持物（多聚賴氨酸硅膠）上，然后與熒光標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)每個(gè)探針分子雜交信號(hào)的強(qiáng)度，獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。 n 2. 序列多態(tài)性 DNA鏈內(nèi)發(fā)生較大片段的缺失、重復(fù)、插入等變異。Southern 印跡雜交 將制備的DNA經(jīng)酶切電泳、再轉(zhuǎn)印到固相支持物上，用探針雜交后進(jìn)行檢測(cè)的方法，用于 DNA/DNA雜交。還可觀察被測(cè)基因在細(xì)胞內(nèi)或染色體上的定位?；蛟\斷的基本流程：制備基因探針； 提取目的基因，獲得單鏈DNA； PCR擴(kuò)增DNA； 目的DNA與尼龍膜結(jié)合； 探針與目的DNA互補(bǔ)配對(duì)； 沖洗尼龍膜； 檢測(cè)雜合分子基因診斷的基本技術(shù) 一、核酸分子雜交（hybridization）根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，將樣品DNA/RNA雙鏈經(jīng)變性處理，加入已標(biāo)記的單鏈DNA/RNA探針，樣品中與探針互補(bǔ)的DNA/RNA序列可與探針形成雜交雙鏈DNA，通過顯示標(biāo)記物或其它方法來檢測(cè)特定的核酸片段。而且待測(cè)標(biāo)本微量。 GADD45蛋白也可以P21/CDK/ GADD45蛋白/PCNA四聚體形式，促使DNA修復(fù) P53蛋白還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：當(dāng)DNA損傷不能修復(fù)時(shí)，P53可誘導(dǎo)Bax基因表達(dá) ， 形成Bax / Bax 復(fù)合體，因Bax基因具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 P53的生物學(xué)功能： 抑制細(xì)胞增殖 P53基因時(shí)刻監(jiān)控著基因的完整性，一旦細(xì)胞DNA遭到損害，P53蛋白與基因的 DNA相應(yīng)部位結(jié)合，起特殊轉(zhuǎn)錄因子作用，活化 p21基因轉(zhuǎn)錄，P21蛋白與cyclinE/CDK2結(jié)合抑制該激酶的活性和其對(duì)PRb的磷酸化，使細(xì)胞停滯于G1期。 216。8分別編碼五個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域（ⅠⅤ）：1319，117143，171181，236258，270286。Rb基因的作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期 pRB具有兩種形式: 磷酸化與非磷酸化 非磷酸化的P105為非活性型, 可抑制細(xì)胞增殖，磷酸化的P105為活性型可促進(jìn)細(xì)胞增殖Rb基因?qū)δ[瘤的抑制作用與轉(zhuǎn)錄因子E2F有關(guān)E2F是一類激活轉(zhuǎn)錄作用的活性蛋白，控制著S期的重要蛋白質(zhì)的合成（如DNA合成酶），在G0、G1期，低磷酸化型的Rb蛋白與E2F結(jié)合成復(fù)合物，使E2F處于非活化狀態(tài)；在S期，Rb蛋白被磷酸化而與E2F解離，E2F變成游離狀態(tài)，細(xì)胞立即進(jìn)入增殖階段。 不同的癌基因有不同的激活方式，一種癌基因也可有幾種激活方式。原癌基因擴(kuò)增使轉(zhuǎn)錄模板增加，mRNA的水平增高，表達(dá)活性增加，產(chǎn)生過量的表達(dá)蛋白而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。 : 病毒癌基因?qū)Σ《颈旧頍o關(guān)緊要，卻可使宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化，引起腫瘤，而細(xì)胞癌基因?qū)?xì)胞的生長、分化和功能活動(dòng)卻是至關(guān)緊要的癌基因的激活機(jī)理 1. 點(diǎn)突變：原癌基因在射線或化學(xué)致癌劑作用下，可能發(fā)生單個(gè)堿基的替換導(dǎo)致點(diǎn)突變，從而改變了表達(dá)蛋白的氨基酸組成，造成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)異常。在正常細(xì)胞內(nèi)可以表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖和分化的功能。這些基因在正常情況下不表達(dá)或僅限量表達(dá)，當(dāng)其被激活時(shí)則可引起癌變，通常將病毒中的這類癌基因稱為病毒癌基因(vonc)，細(xì)胞中存在的癌基因稱為細(xì)胞癌基因(conc),由于conc在正常細(xì)胞中以非激活狀態(tài)存在，故又稱為原癌基因(protoonc). 原癌基因：未激活的細(xì)胞癌基因在人體正常細(xì)胞中存在是一種正?；蜃饔茫烧{(diào)控細(xì)胞生長和分化，廣泛存在于生物界中，從酵母到人的細(xì)胞中都存在。 用硫代磷核苷酸,在DNA聚合酶催化和DNA連接酶作用下，形成異源dsDNA分子，再用NciⅠ消化該異源dsDNA分子，可獲的高效率的定點(diǎn)突變分子。為了使靶基因的特點(diǎn)位點(diǎn)發(fā)生突變，所設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物的序列除了所需的突變堿基外，其余的序列則與靶基因編碼鏈的特定區(qū)段完全互補(bǔ)。 (二) 突變的多方向性與復(fù)等位基因突變的多方向性：指基因突變可以多方向發(fā)生，即基因內(nèi)部多個(gè)突變部位分別改變后會(huì)產(chǎn)生多種等位基因形式?？赡嫘?基因突變的發(fā)生方向是可逆的。生殖細(xì)胞突變：生殖細(xì)胞突變發(fā)生在種系(germ line)中。致死突變: 影響生物體的生活力，導(dǎo)致個(gè)體死亡的一類突變。3．表型特征:形態(tài)突變: 突變主要影響生物體的外在可見的形態(tài)結(jié)構(gòu)，故又稱可見突變。突變分類：：點(diǎn)突變 DNA被化學(xué)修飾或復(fù)制時(shí)發(fā)生錯(cuò)配 ，使一個(gè)堿基變成另一個(gè)堿基。三、 基因?qū)敕?體外連接的重組DNA分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞才能大量復(fù)制、增殖和表達(dá)。DNA連接酶：將兩段DNA分子拼接的酶叫DNA連接酶。常用工具酶：限制性內(nèi)切酶（RE）是一類特異性水解雙鏈DNA的磷酸二酯酶。許多刺激因子如細(xì)胞因子，氧自由基等均可使其活化。磷蛋白磷酸酶(Protein Phosphatase, PP) 使被磷酸化的蛋白質(zhì)脫去無機(jī)磷酸鹽，回復(fù)基本狀態(tài)。 配體：神經(jīng)遞質(zhì) 舉例：乙酰膽堿受體 GPCR 此類受體接受的信息 需G蛋白的轉(zhuǎn)換才能傳遞到靶細(xì)胞內(nèi)，即與G蛋白偶聯(lián)。第六章 細(xì)胞信號(hào)傳遞細(xì)胞信號(hào)傳遞：信息物質(zhì)（分子）通過一系列中間環(huán)節(jié)把信號(hào)傳遞到靶細(xì)胞內(nèi)，使靶細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)細(xì)胞信號(hào)傳遞的基本過程：特定細(xì)胞合成并分泌信號(hào)分子——信號(hào)分子通過擴(kuò)散或血循環(huán)到達(dá)靶細(xì)胞——靶細(xì)胞的受體識(shí)別并結(jié)合信號(hào)——通過一系列的化學(xué)反應(yīng)將信號(hào)傳遞到靶細(xì)胞內(nèi)——生物學(xué)效應(yīng)細(xì)胞間的信號(hào)分子，又稱第一信使，細(xì)胞分泌的具有調(diào)節(jié)靶細(xì)胞生命活動(dòng)的化學(xué)物質(zhì)。 沉默子：能抑制上游或下游基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。順式作用元件：凡能激活/阻遏基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。，甲基化——促進(jìn)異染色質(zhì)的形成。組蛋白密碼：核小體核心組蛋白N端尾區(qū)，具細(xì)胞信息潛在的儲(chǔ)存功能，是提供表型遺傳信息的豐富來源，此信息可傳遞至子代；尾區(qū)位點(diǎn)修飾及其組合，構(gòu)成一套限定染色質(zhì)局部轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的密碼。異染色質(zhì) 堿性染料著色深而不均，DNA復(fù)制晚而慢，對(duì)核酸酶不敏感，所含基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白甚少，富含高度重復(fù)序列，核小體陣列規(guī)則，高度壓縮。表觀遺傳變異是指，在基因的DNA序列沒有發(fā)生改變的情況下，基因功能發(fā)生了可遺傳的變化，并最終導(dǎo)致了表型的變化。 非編碼RNA（NonCoding RNA），指的是不被翻譯成蛋白質(zhì)的RNA，如tRNA, rRNA等，這些RNA不被翻譯成蛋白質(zhì)，但是其中有一些會(huì)參與