【正文】 肌肉細(xì)胞 actin gene actin gene (CpG) (mCpG) 成纖維細(xì)胞 低速率 轉(zhuǎn)錄 ? Promoter CpG 甲基化與轉(zhuǎn)錄 γ globin gene –200 — +90 有甲基化基團(tuán) mCpG 轉(zhuǎn)錄受阻 除去部分 mCpG 轉(zhuǎn)錄受阻 除去所有 CpG 轉(zhuǎn)錄 5氮胞苷抑制甲基化 ,瞬時(shí)去甲基化 5NC ? 成纖維細(xì)胞 肌肉細(xì)胞 ( 多核 ,有條紋 , 可收縮 ) ?甲基化與小鼠胚胎發(fā)育 knock out 甲基轉(zhuǎn)移酶 gene C 胚胎發(fā)育早期 甲基化格式變換 ,其后細(xì)胞內(nèi) DNA維持特定的甲基化狀態(tài) 配子發(fā)生期 ,不同性別配子的甲基化格式是特定的?？捎枚ㄌ欠ū壬珳y定 DNA or RNA 含量。DNA DNA 蛋白質(zhì) ? ρ值不同的 dsDNA的分離 (ρ值差 ) 影響 ρ 值的因素： ? (G + C)% ? 甲基化 , ρ ? ? 重原子取代 ρN15 ρN14 ? 重金屬原子結(jié)合 Cs2SO4 Ag+ GCrich Hg2+ ATrich ? 堿性 CsCl 離心分離 DNA 兩條互補(bǔ)鏈 dsDNA變性 → CsCl 離心 → 兩個(gè) 峰（兩條 ssDNA） 變性 DNA 輕鏈（ L） 重鏈（ H） G + T 比例高， ρ大 pH 12 下 , GN1 and TN3 解離，結(jié)合 Cs+ 多， ρ 升高 . ? 分離不同構(gòu)型 DNA DNA 結(jié)合具插入作用藥物 (溴乙錠 EB), ρ值降低 . cc, oc和 l DNA 結(jié)合藥物的量不同 , ρ變化不同 . ccDNA結(jié)合少； oc和 l DNA結(jié)合多 . 純化質(zhì)粒 ccDNA , 除 RNA , oc ,l DNA 和染色體 DNA. 2. 膠電泳 快速、簡便、設(shè)備簡單、樣品用量少 …… 核酸 pI= , pH 時(shí) , NA帶負(fù)電荷 . * Pi pK1= 1 , pK2=6 完全解離 * +NH= NH= pK= 完全解離 * NH N + H+ pK= 基本未解離 核酸分子大小不同 ,荷質(zhì)比相同 .荷 /質(zhì) = n+1/n 電泳緩沖液 : TAE TrisNaAcEDTA pH TBE TrisBoric acidEDTA pH ? agarose gel ~50kb (恒電場 ) 30~10,000kb (交變脈沖電場） ?PAGE 5~1000 bp , 分辨率 1bp 192 5 13 29 32 39 49 60 溫度 (電壓 )對(duì)遷移率的影響 鹽濃度對(duì)遷移率的影響 ? 分子量相同 ,構(gòu)型不同 ,遷移率不同 遷移率 : cc l oc ? ccDNA超螺旋數(shù)不同 ,遷移率不同 ? ssDNA or RNA分子內(nèi)折疊影響遷移率 變性膠 (脲、甲酰胺），醛處理 RNA ? 線狀 DNA的形狀 彎曲、有泡 遷移慢 ? 與蛋白質(zhì)結(jié)合遷移慢 gel retardation d. 提高分辨率的方法 ? 控制電壓 ? 膠濃度梯度 520% PAGE 分離范圍大 ? 緩沖液濃度梯度 TBE buffer 梯度，遷移速度變化 . ? 楔型膠 改變遷移速度 ? 雙向電泳 影響遷移率因素 : 膠濃度、變性劑、 pH ? 濃度雙向 Ⅰ 向： 10% PAGE Ⅱ 向： 20%PAGE 80400Nts RNA 的分離 ? pH 雙向 Ⅰ 向： 分子量，電荷 Ⅱ 向： 分子量 ? 變性劑雙向 Ⅰ 向 : agarose gel 片段大小 Ⅱ 向：變性劑梯度 PAGE ? 交變脈沖電場膠電泳 分離 10,000kb(10Mb) DNA 片段 正交變電場：電流方向垂直變化 Phage MS2 RNA片段的分離 tRNAs的分離 鼠肝 雞肝 + + 正交變電場 1 2 3 1. yeast染色體 16 條 ,2202500kb 2. λDNA N 3. DNA NotI Yeast 16條染色體 DNA 電泳圖譜 e. 染色劑 ?溴乙錠 (ethidium bromide EB),嵌入 bp 254nm,300nm,360nm UV激發(fā) , 590nm熒光 ? 銀染 PAGE , AgNO3 染 ss,ds DNA RNA EBDNA 復(fù)合物 光損害 λnm 靈敏度 nick dimer 光褪色 254 較高 1 多 1 多 1 嚴(yán) 重 300 最高 少 1/15 少 1/84 輕 360 低 少 1/72 無 無 ? 電泳 透析袋、 DEAE纖維素膜 ? 浸出法 ? 低熔點(diǎn) agarose gel (LMP agarose ) ? 離心法 微孔膜 ? 玻璃粉 回收樣品， EtOH ? 回收率 : 1 kb 95% 5 kb 75% 20 kb 20% 3. 柱層析 分離容量大， mgg 級(jí) a. 排阻層析 b. 離子交換層析 c. 反向?qū)游?(RPC) d. 硝酸纖維素柱層析 4. 分子雜交法 a. oligo dT 纖維素 b. Southern blot 分離特定基因片段 5. 重組 DNA法 目的片段的擴(kuò)增和純化