【正文】 5. 保存 防止降解、變性 措施：滅菌、低溫、鹽濃度、 pH、 EDTA…… DNA TE buffer,4 –20℃, 70 % EtOH RNA 冰凍干燥、低溫 6. 純度的初步鑒定 a. UV吸收曲線 b. UV吸收比值 DNA A260/A280 = RNA A260/A280 = 核酸的含量測定 (260nm,1cm 光徑 ) 1 A260 50μg/ml dsDNA 40μg/ml ssDNA, RNA 36μg/ml oligo Nts c. 膠電泳 定量 , 定性 四 . 核酸的純化 ? 沉降速度法 被分離物質(zhì)在強大的離心力場中因 沉降速度 不同而分離 . (速度區(qū)帶超離心 ). ? 沉降平衡法 被分離物質(zhì)在離心時因 浮密度 不同進行分離 .(浮密度梯度 or 等密度梯度超離心 ). ? 浮密度 ρ 是溶劑化密度 ,即核酸銫鹽水化物 ( CsCl,H2O,NA )的密度 . ? 不同介質(zhì)下 ,核酸的 ρ 不同 . CsCl ρ DNA= 。DNA DNA 蛋白質(zhì) ? ρ值不同的 dsDNA的分離 (ρ值差 ) 影響 ρ 值的因素： ? (G + C)% ? 甲基化 , ρ ? ? 重原子取代 ρN15 ρN14 ? 重金屬原子結合 Cs2SO4 Ag+ GCrich Hg2+ ATrich ? 堿性 CsCl 離心分離 DNA 兩條互補鏈 dsDNA變性 → CsCl 離心 → 兩個 峰（兩條 ssDNA） 變性 DNA 輕鏈（ L） 重鏈（ H） G + T 比例高， ρ大 pH 12 下 , GN1 and TN3 解離，結合 Cs+ 多， ρ 升高 . ? 分離不同構型 DNA DNA 結合具插入作用藥物 (溴乙錠 EB), ρ值降低 . cc, oc和 l DNA 結合藥物的量不同 , ρ變化不同 . ccDNA結合少； oc和 l DNA結合多 . 純化質(zhì)粒 ccDNA , 除 RNA , oc ,l DNA 和染色體 DNA. 2. 膠電泳 快速、簡便、設備簡單、樣品用量少 …… 核酸 pI= , pH 時 , NA帶負電荷 . * Pi pK1= 1 , pK2=6 完全解離 * +NH= NH= pK= 完全解離 * NH N + H+ pK= 基本未解離 核酸分子大小不同 ,荷質(zhì)比相同 .荷 /質(zhì) = n+1/n 電泳緩沖液 : TAE TrisNaAcEDTA pH TBE TrisBoric acidEDTA pH ? agarose gel ~50kb (恒電場 ) 30~10,000kb (交變脈沖電場） ?PAGE 5~1000 bp , 分辨率 1bp 192 5 13 29 32 39 49 60 溫度 (電壓 )對遷移率的影響 鹽濃度對遷移率的影響 ? 分子量相同 ,構型不同 ,遷移率不同 遷移率 : cc l oc ? ccDNA超螺旋數(shù)不同 ,遷移率不同 ? ssDNA or RNA分子內(nèi)折疊影響遷移率 變性膠 (脲、甲酰胺），醛處理 RNA ? 線狀 DNA的形狀 彎曲、有泡 遷移慢 ? 與蛋白質(zhì)結合遷移慢 gel retardation d. 提高分辨率的方法 ? 控制電壓 ? 膠濃度梯度 520% PAGE 分離范圍大 ? 緩沖液濃度梯度 TBE buffer 梯度，遷移速度變化 . ? 楔型膠 改變遷移速度 ? 雙向電泳 影響遷移率因素 : 膠濃度、變性劑、 pH ? 濃度雙向 Ⅰ 向： 10% PAGE Ⅱ 向： 20%PAGE 80400Nts RNA 的分離 ? pH 雙向 Ⅰ 向： 分子量，電荷 Ⅱ 向： 分子量 ? 變性劑雙向 Ⅰ 向 : agarose gel 片段大小 Ⅱ 向：變性劑梯度 PAGE ? 交變脈沖電場膠電泳 分離 10,000kb(10Mb) DNA 片段 正交變電場：電流方向垂直變化 Phage MS2 RNA片段的分離 tRNAs的分離 鼠肝 雞肝 + + 正交變電場 1 2 3 1. yeast染色體 16 條 ,2202500kb 2. λDNA N 3. DNA NotI Yeast 16條染色體 DNA 電泳圖譜 e. 染色劑 ?溴乙錠 (ethidium bromide EB),嵌入 bp 254nm,300nm,360nm UV激發(fā) , 590nm熒光 ? 銀染 PAGE , AgNO3 染 ss,ds DNA RNA EBDNA 復合物 光損害 λnm 靈敏度 nick dimer 光褪色 254 較高 1 多 1 多 1 嚴 重 300 最高 少 1/15 少 1/84 輕 360 低 少 1/72 無 無 ? 電泳 透析袋、 DEAE纖維素膜 ? 浸出法 ? 低熔點 agarose gel (LMP agarose ) ? 離心法 微孔膜 ? 玻璃粉 回收樣品， EtOH ? 回收率 : 1 kb 95% 5 kb 75% 20 kb 20% 3. 柱層析 分離容量大， mgg 級 a. 排阻層析 b. 離子交換層析 c. 反向?qū)游?(RPC) d. 硝酸纖維素柱層析 4. 分子雜交法 a. oligo dT 纖維素 b. Southern blot 分離特定基因片段 5. 重組 DNA法 目的片段的擴增和純化