生化與分子生物學(xué)技術(shù)原理-wenkub
2023-01-31 10:44:22 本頁面
【正文】 核酸的純化 ? 沉降速度法 被分離物質(zhì)在強(qiáng)大的離心力場中因 沉降速度 不同而分離 . (速度區(qū)帶超離心 ). ? 沉降平衡法 被分離物質(zhì)在離心時(shí)因 浮密度 不同進(jìn)行分離 .(浮密度梯度 or 等密度梯度超離心 ). ? 浮密度 ρ 是溶劑化密度 ,即核酸銫鹽水化物 ( CsCl,H2O,NA )的密度 . ? 不同介質(zhì)下 ,核酸的 ρ 不同 . CsCl ρ DNA= 。 20種 3’ Nt, 22種 5’ Nt, 40種 Ns, 14種抗水 解 NmNp dimer. AmGp ~GmAp CmUp ~ UmCp 2. 鑒定 a. 標(biāo)準(zhǔn)品對照 (電泳 ,層析 ) UV吸收檢出 吸收 UV藍(lán)紫色斑點(diǎn) , G藍(lán)色熒光 , D無吸收。 ? 溫和 ( Soft ) 烷化劑 硫酸二甲酯 甲基硫烷 烷基化物 DMS MMS MeI Me N GN7 AN1 CN3 TN3 DMS作用于 dsDNA AN3(Me) , 阻止 DNA pol. ? 強(qiáng) (Hard) 烷化劑 N甲基 N亞硝基脲 (MNU) N乙基 N亞硝基脲 (ENU) Me N , O 核酸 50% 磷酸酯烷化 烷化劑直接致癌 DMS GO6 : GN7 = : 1 MNU GO6 : GN7 = : 1 ( 肝 ) GO6 : GN7 = : 1 ( 腦 ) GN7(Me)不改變 G:C配對 GO6(Me)不影響 DNA pol,但改變堿基對 , G T b. 鹵化反應(yīng) 嘧啶 5 位 5FU 抗癌藥 鹵素分子 嘌呤 8 位 8BrPu 標(biāo)記 c. 與醛類反應(yīng) 堿基的 環(huán)外 –NH2 AMP: N6NH2 GMP: N2NH2 甲醛是 DNA不可逆變性劑 ?鑒定 ssDNA or dsDNA ?破壞 RNA高級(jí)結(jié)構(gòu) ， 消除結(jié)構(gòu)對電泳遷移 率的影響 d. 核糖上的反應(yīng) ? 核糖的氧化反應(yīng) 核糖的 2’， 3’順二醇 被高碘酸 ( HIO4)氧化成 順二醛 ，胺催化 β 消除反應(yīng) ，同時(shí)堿基脫落 , 生成磷酸，堿基和糖碎片。 下一代配子保持相同格式 Igf2 gene IGFⅡ 胰島素 like生長 因子依賴于父本表達(dá) Igf2R gene IGFⅡR 胰島素 like生長 因子受體依賴于母本表達(dá) 一條 X染色體的失活 ? 甲基化格式的建立、維持和改變 從無到有 (de novo)甲基化 雙鏈相對 CpG mCpG 確立新格式 甲基化的維持 脫甲基 被動(dòng) 復(fù)制后不再甲基化 主動(dòng) 甲基轉(zhuǎn)移 堿基切除修復(fù) ? CpGrich islands 基因組中存在異常非甲基化 CpG順序簇 高含量 C+G 高頻率 CG dimer (10/100bp ) 分布不均 , 長 12 kb， 間隔 ~100 kb 非甲基化 –CpG 存在 ： housekeeping genes tissues specific genes 5’ 啟動(dòng)子 ——轉(zhuǎn)錄區(qū) 腺嘌呤磷酸核糖 轉(zhuǎn)移酶 CpG密度 1/100bp CpG密度 10/100bp –100 ~ 300 1. 二氫葉酸還原酶基因 2. 次黃嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖酶基因 3. 核糖體蛋白質(zhì)基因 1 2 3 CG mCG 抑制轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì) MeCP1 *CpG 成簇 MeCP2 *CpG DNA甲基化有助于基因關(guān)閉 五 . 核酸及其化學(xué)組分的化學(xué)反應(yīng) 磷酸二酯鍵 , 磷酸單酯鍵 , N糖苷鍵 a. 酶水解 b. 酸堿水解 ? 磷酸二酯鍵 ? 酸 熱強(qiáng)酸 dA,dG 30mi （ 100176。 兩個(gè)原子偏離糖平面的程度可以相等或不等 C2’endoC3’exo C2’exoC3’endo 側(cè)視圖 ? 存在 溶液 : Nt , Ns C2’endo ~ C3’endo DNA : BDNA C2’endo ADNA(RNA) C3’endo ZDNA 胞苷 (C) C2’endo ( 反式） 鳥苷 (G) C3’endo（順式 ） (Bform double DNA) (Aform double DNA) 三 . 核苷的順反構(gòu)象 ( synanti 構(gòu)象 ) 核糖和堿基以 N糖苷鍵連接成核苷，核苷中堿基平面繞糖苷鍵旋轉(zhuǎn)形成核苷的順反構(gòu)象。2poly U 按 1:2結(jié)合成復(fù)合物 (三鏈 ) 抗生素 第二信使 嘌呤霉素 細(xì)胞激動(dòng)素 能源庫 輔酶 二 . 糖環(huán)的折疊形式 構(gòu)型 (configuration)共價(jià)化合物中 ,各個(gè)原子在空間的相對排列關(guān)系。生化與分子生物學(xué) 技術(shù)原理 曹凱鳴 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 2022年 11月 第一章 核酸的基本結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 一 .基本的化學(xué)組成 經(jīng)不同程度水解可獲得核酸各種組成部分 核苷酸 nucleotide Nt 核苷 nucleoside Ns 堿基 嘌呤 purine Pu 嘧啶 pyrimidine
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