【正文】 蛋白信息的初步獲得 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 32 蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析技術(shù) 基質(zhì)輔助激光解析電離：飛行質(zhì)譜儀 (MALDITOF)。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 22 LR反應(yīng) 可將目的片段從Entry載體 重組 到表達(dá)載體中。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 17 cDNA差示分析法克隆基因 —— RDA 代表性差異分析 (representational difference analysis, RDA)： RDA充分發(fā)揮了 PCR以 指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈 DNA模板而以 線性形式擴(kuò)增單鏈 模板的特性，通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換 cDNA兩端接頭等方法，特異擴(kuò)增目的基因片段。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 14 ? 第五步：加入另一種 dNTP，使第 2－ 4步反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的 DNA序列信息。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 12 ? 第三步：在 ATP硫酸化酶作用下，生成的 PPi與 APS結(jié)合形成 ATP。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 9 ? 每輪測序反應(yīng)中，只加入 一種 dNTP，如果該 dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的 焦磷酸 基團(tuán) (PPi)，PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號，并由 PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個峰值，每個峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比，然后加入下一種 dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 7 ?PCR反應(yīng)中， Taq酶以 P1為引物合成新的 DNA鏈，隨著反應(yīng)的進(jìn)行， Taq酶接觸到 P3并激發(fā)其5→3 外切酶活性，使 P3從 5端開始降解，最后DNA鏈得以延伸，而 P3探針上的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)由于不再在一個分子上，熒光基團(tuán)釋放而發(fā)出熒光信號。 P3探針的 539。端熒光基團(tuán)和 339。 Taqman技術(shù)原理： ? 探針設(shè)計上，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)換 (FRET)技術(shù)，探針539。常是生物性狀發(fā)生改變的直接原因。 單體型 (Haplotype)：染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的 SNP等位位點被稱作單體型。相鄰 SNPs的等位位點傾向于以一個整體信息傳遞給后代。 ? 基因調(diào)控區(qū) SNP(pSNP)：影響基因表達(dá)量的多少。和 339。端猝滅基團(tuán)緊鄰在一起，供體所發(fā)熒光由于其光譜在空間上接近受體染料而被猝滅，只有當(dāng)兩者分離時才能檢測到供體所發(fā)出的熒光。端和 339。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 8 焦磷酸測序法： ? 核心：由四種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)反應(yīng)。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 10 ? 第一步： 1個特異性的測序引物和單鏈 DNA模板結(jié)合，然后加入酶混合物 (DNA Polymerase、 ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶 )和底物混合物 (5’磷酰硫酸 APS和熒光素 Luciferin)。在熒光素酶催化下，生成的 ATP又與熒光素結(jié)合形成 氧化熒光素 ，同時產(chǎn)生可見光。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 15 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 16 SNP應(yīng)用 人類基因單體型圖的繪制。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 18 因試驗對象 (Tester)和供試探針 (Driver)在接受差示分析前均經(jīng)一個 4堿基切割酶處理，形成平均長度 256bp的代表群(representation)，保證絕大部分遺傳信息能被擴(kuò)增。 Entry載體上基因兩端具有 attL1和 attL2位點，目的載體中含有attR1和 attR2位點，通過重組形成新的位點 attB1和 attB2，從而將目的基因亞克隆到表達(dá)載體中。 電噴霧質(zhì)譜 ESIMS： ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 33 從 2D膠中分離得到的或其它來源的 蛋白質(zhì) ，酶解成 小肽 后與基質(zhì)混合，將樣品混合物點到 金屬靶 表面上并使之干燥 結(jié)晶 ，然后用 激光轟擊 ，將呈 離子化氣體 的待分析物從靶表面噴射出去。 離子進(jìn)入質(zhì)譜，得到質(zhì)譜圖。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 39 在轉(zhuǎn)錄組水平上，任何長度超過 910個堿基的核苷酸片段都可能代表一種特異性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。 分為 RNA原位雜交和染色體原位雜交。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 45 ? 按標(biāo)記物不同又可分為 直接標(biāo)記法 和 間接標(biāo)記法 。 缺點 是信號不能放大。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 51 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 52 大引物誘變法：