【正文】 ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)、熒光素酶 (luciferase)、雙磷酸酶 (apyrase)。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 11 ? 第二步：向反應(yīng)體系中加入1種 dNTP，如果它剛好能和DNA模板的下一個堿基配對，則會在 DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的 339。通過 CCD光學(xué)系統(tǒng)即可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。 SNP與疾病易感基因的相關(guān)性分析。每次 T減 D反應(yīng)中兩者物質(zhì)的量比要求達(dá)到 1:100或更高，經(jīng) 23次重復(fù)， T群體非特異性序列幾乎沒有偶然逃脫的可能性。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 23 雙向電泳 等電聚焦：蛋白質(zhì)在含有載體兩性電解質(zhì)形成的一個連續(xù)而穩(wěn)定的 線性 pH梯度 中電泳。 離子化的氣體中每個分子帶有一個或更多的正 電荷 ，這些氣體肽段在 電場 中被 加速 后， 到達(dá)檢測器的時間由肽段的質(zhì)量和其所帶電荷數(shù)的比值 (m/z)決定。 用計(jì)算機(jī)軟件將質(zhì)譜圖與蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，從而鑒定出蛋白。 因此，用特定限制性核酸內(nèi)切酶分離轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中具有基因特異性的 910個堿基的核苷酸序列并制成標(biāo)簽。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 43 RNA原位雜交：用放射性或非放射性 (地高辛、生物素等 )標(biāo)記的特異性探針與被固定的 組織切片 反應(yīng)，若細(xì)胞中存在與探針互補(bǔ)的 mRNA分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈 RNA，就可通過檢測放射性標(biāo)記或酶促免疫反應(yīng)顯色，對該基因的表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞水平上做出 定性定量分析 。 ? 用生物素 (biotin)或地高辛配體 (digoxingenin)標(biāo)記稱為 間接標(biāo)記 ，雜交后需要通過免疫熒光抗體檢測方能看到熒光信號，因而步驟較多、操作麻煩，其 優(yōu)點(diǎn) 是在信號較弱或較小時可經(jīng)抗原抗體反應(yīng) 擴(kuò)大 ，需進(jìn)行染色體定位的基因片段往往較小，因而間接標(biāo)記具有其優(yōu)勢。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 47 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 48 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 49 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 50 基因定點(diǎn)突變技術(shù) 重疊延伸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變： 大引物誘變法： 重疊延伸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變： ? 使用帶突變堿基的互補(bǔ)引物對兩段目的基因序列分別進(jìn)行第一輪 PCR擴(kuò)增。 ? 將第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物作為第二輪 PCR擴(kuò)增的引物來使用，從而使第二輪擴(kuò)增的產(chǎn)物帶突變的堿基。 此外，該體系也是分析鑒定細(xì)胞中 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 與順 式作用元件 相互作用的有效方法。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 59 實(shí)驗(yàn)方法： ? 首先利用基因重組技術(shù)將編碼已知蛋白的 DNA序列連接到帶有酵母轉(zhuǎn)錄因子 BD編碼區(qū)的表達(dá)載體上。 ? 分離有報告基因活性的酵母細(xì)胞，得到所需要的 “ 獵物 ”載體，獲得 與已知蛋白相互作用 的新基因。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 69 2022年， RNA的研究進(jìn)展被美國 《 科學(xué) 》 雜志評為重大科技突破； 2022年“ RNA干擾”作為當(dāng)年最重要的科學(xué)研究成果之一，再次入選“十大科技突破”； 2022年 12月 20日， Science雜志將“ Small RNA amp。 RNA研究的突破性進(jìn)展，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域近 20年來，可與 HGP（人類基因組計(jì)劃，生物通網(wǎng)站注）相提并論的最重大成果之一。 引發(fā) RNAi的雙鏈 RNA長度必須在 30nt以上，具有 539。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 71 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 72 miRNA 研究發(fā)現(xiàn) miRNA的主要功能是調(diào)節(jié)生物體內(nèi)在的與機(jī)體生長、發(fā)育、疾病發(fā)生過程有關(guān)的基因的表達(dá)，而且研究人員推測這種小分子調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 73 MicroRNA也可以寫做 miRNA ，是一種 21－25nt長的單鏈小分子 RNA。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 75 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 76 MiRNA的作用方式 miRNA基因是一類高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分為兩種：第一種以線蟲lin4為代表，作用時與靶標(biāo)基因不完全互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而抑制翻譯而不影響 mRNA的穩(wěn)定性（不改變 mRNA豐度），這種 miRNA是目前發(fā)現(xiàn)最多的種類； 第二種以擬南芥 miR171為代表，作用時與靶標(biāo)基因完全互補(bǔ)結(jié)合，作用方式和功能與siRNA非常類似，最后切割靶 mRNA； ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 77 MiRNA的特異性 研究表明 MiRNAs在物種間具有高度的保守性、時序性和組織特異性 —— 在特定的時間、組織才會表達(dá)。 MiRNA：是內(nèi)源性的，是一種非編碼的 RNA；由 miRNA基因表達(dá)出最初的 primiRNA分子。 原理：在凝膠電泳中 ， 由于電場的作用 ， 裸露的 DNA朝正電極移動的距離與其分子量的對數(shù)成反比 。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 85 ● ●