分子生物學(xué)實驗-閱讀頁
2024-09-03 20:31本頁面
【正文】 簡述ＰＣＲ基本原理 ? ２ ． 進(jìn)行一次成功的ＰＣＲ反應(yīng)順注意 ? 哪些問題 。 二 、 實驗原理 RNA是一類極易降解的分子 ， 要得到完整的 RNA， 必須最大限度地抑制提取過程中內(nèi)源性及外源性核糖核酸酶對RNA的降解 。 細(xì)胞裂解后 ， 除了RNA， 還有 DNA、 蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片 ， 通過酚 、 氯仿等有機溶劑處理得到純化 、 均一的總 RNA。 4． 高壓滅菌鍋 5． 研缽 、 剪刀 、 一次性手套等 一、目的和內(nèi)容 目的：掌握 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，掌握蛋白質(zhì)印跡技 術(shù)的基本原理和方法。 實驗四 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（ Western blotting） 二、主要儀器、材料和試劑 儀器和材料 蛋白質(zhì)電泳槽，蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移槽一套（六一儀器廠），硝酸纖維素濾膜（黃巖化工廠），直徑為20cm 及 10cm 玻璃平皿各一個，剪刀、鑷子、刀片、一次性手套，普通濾紙，雞卵清白蛋白，雞卵清免疫兔的抗血清，辣根過氧化酶 羊抗兔抗體（ 1： 500 稀釋），四氯奈酚或者二氨基聯(lián)苯胺，過氧化氫。 （ 2） TBS 要 TrisHCl NaCl， Tween20 緩沖液： 20mmol/L Tris HCl， 500mmol/L NaCl， % Tween20， PH： 。 （ 4） Blocking 溶液（封閉液）： 10%牛血清 TBS。 （ 6）轉(zhuǎn)移緩沖液： 25mmol/L Tris， 192 mmol/L Glycine 20%MethnolL， . （ 7）去離子雙蒸水。 2. 2 mol/L NaAc、 mol/L EDTA、 4 mol/L異硫 氰酸胍 、 4mol/L LiCl等均用 DEPC水配制 。 放入研缽 ， 在液氮中研磨成粉末狀 ， 移入 10 mL離心管 。 2. 4℃ ， 8000 r/min， 離心 13 min。 4. 加入 2倍體積無水乙醇 ， 70℃ ， h。 三、操作操作步驟 制備兔抗雞蛋清白蛋白血清 將雞蛋清與生理鹽水 1： 1 混勻后，與石蠟有完全佐劑和不完全佐劑研磨而成抗原，選擇兩只家兔，皮下多點注射 3 次，每周一次，加強一次，每次四個點，每點 抗原， 5 周后頸動脈放血、取血清作為Western Blotting 的第一抗體。 7. 移入 mL離心管中，冰浴 2 h。 9. 棄上清，在沉淀中加入 400 uL DEPC水，再加入 400 uL 氯仿，混勻。 11. 取上清，并加入 1/10體積 3 mol/L NaAc（ pH ）， 2 倍體積無水乙醇， 20℃ ，放置 30 min。 13. 將沉淀 RNA用 70%乙醇洗滌 2次。 15. 加 30 uL DEPC水溶解， 70℃ 保存。 1． %變性瓊脂糖凝膠 (40 mL) g,加入 DEPC水 mL,5X電泳緩沖液 4 mL, 加熱使溶 解 ， 稍冷卻加入甲醛 mL, 混勻 ， 室溫凝固 泳 檢測 3. 電泳檢測 將 %變性瓊脂糖凝膠放入水平電泳槽中 ， 加 1 MOPS電泳緩沖液 ， 覆蓋凝膠約 1 mm。 五 、 注意事項 1． 在研磨過程中 ， 利用液氮時刻使組織保持冰凍狀態(tài) 。 思考題： 1. 實驗中所用到的各試劑的作用是什么 ? 焦碳酸二乙酯 (DEPC), 嗎啉代丙烷磺酸 (MOPS), 異硫氰酸胍 , 醋酸鈉 (NaAc), 氯仿 , 苯酚 , 甲醛 , 乙醇 , 乙二胺四乙酸 (EDTA), 異丙醇
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