【正文】 鏈和第二鏈,將雙鏈cDNA和載體連接,然后轉化擴增, 即可獲得cDNA文庫,構建的cDNA文庫可用于真核生物基因的結構、表達和調控的分析?？傊甤DNA的合成和克隆已成為當今真核分子生物學的基本手段。cDNA合成及克隆的基本步驟包括用反轉錄酶合成cDNA第一鏈,聚合酶合成cDNA第二鏈,加入合成接頭以及將雙鏈DNA克隆到于適當載體(噬菌體或質粒)。由于mRNA分子的結構特點,容易受RNA酶的攻擊反應而降解,加上RNA酶極為穩(wěn)定且廣泛存在,因而在提取過程中要嚴格防止RNA酶的污染,并設法抑制其活性,這是本實驗成敗的關鍵。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小時以上。DEPC是RNA酶的化學修飾劑,它和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)反應而抑制酶活性。試驗所用試劑也可用DEPC處理,%濃度,然后劇烈振蕩10分鐘,再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性。Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。除DEPC外,也可用異硫氰酸胍、釩氧核苷酸復合物、RNA酶抑制蛋白等?！　〖毎麅瓤俁NA制備方法很多,如異硫氰酸胍熱苯酚法等。分離的總RNA可利用mRNA 339。經(jīng)過兩次oligo(dT)纖維素柱,可得到較純的mRNA。 　　二、cDNA第一鏈的合成　　所有合成cDNA第一鏈的方法都要用依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉錄酶)來催化反應。AMV反轉錄酶包括兩個具有若干種酶活性的多肽亞基,這些活性包括依賴于RNA的DNA合成,依賴于DNA的 DNA合成以及對DNA:RNA雜交體的RNA部分進行內切降解(RNA酶H活性)。MLV反轉錄酶能合成較長的cDNA(如大于23kb)。 　　AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶都必須有引物來起始DNA的合成。端poly(A)結合的1218核苷酸長的oligo(dT)。三、cDNA第二鏈的合成　　cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種: 　　(1) 自身引導法 合成的單鏈cDNA 339。但自身引導合成法較難控制反應，而且用S1核酸酶切割發(fā)夾結構時無一例外地將導致對應于mRNA 539。 　　(2) 置換合成法 該方法利用第一鏈在反轉錄酶作用下產(chǎn)生的cDNA:mRNA雜交鏈不用堿變性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。該反應有3個主要優(yōu)點: (1) 非常有效。 (3) 不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈發(fā)夾環(huán)。 （3）隨機引物法：用六核苷酸在DNA鏈上隨機引發(fā)合成第二條鏈 （4）均聚物引發(fā)法 用末端脫氧核苷酸轉移酶，加入一種dNTP,ZAI cDNA第一條鏈3’端加上那個均聚物尾巴，然后用配對的寡聚物作為引物合成第二條鏈； （5）如果序列是已知的，也可以用特異引物來合成第二條鏈。合成的cDNA也可以經(jīng)PCR擴增后再克隆入適當載體?？寺〉某Ｓ梅椒ㄓ校海?）平端連接法，須先用Klenow酶或T4DNA聚合酶將雙鏈cDNA兩端填平補齊，之后以平末端與載體DNA連接，平端連接效率較低；（2）cDNA兩端加接頭或銜接物，接頭需用限制酶水解，因此加接頭前cDNA應先用相應的甲基化酶使其甲基化，以保護cDNA不被消化。二者可使cDNA以粘性末端與載體DNA連接；（3）均聚物加尾法，用末端轉移酶在cDNA兩條鏈的3’端各加均聚（A）或均聚（G），載體DNA的3’加配對的均聚（T）火均聚（C），當cDNA末端與載體DNA末端退火后彼此連接，即可用于轉化宿主細胞；（4）將上述幾步合并進行，例如，用銜接物喝引物合在一起，合成cDNA后即具有粘性末端，或者將引物加在載體DNA上，cDNA合成直接連在載體上。 　　二、設備 　　研缽，冷凍臺式高速離心機，低溫冰箱，冷凍真空干燥器，紫外檢測儀，電泳儀，電泳槽。 　　75%乙醇：用DEPC處理水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。Cl()，1mmol/L EDTA()，% SDS。Cl ()，1mmol/L EDTA ()，% SDS。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染?！　⒔M織在液N中磨成粉末后，再以50100mg組織加入1ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。 　　取上層水相于一新的離心管，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘?！　⌒⌒臈壢ド锨逡?，然后室溫或真空干燥510分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。RNA可進行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于70℃。 　　加氯仿前的勻漿液可在70℃保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，20℃保存一年。 　　(dT)纖維素。 　　用1x柱層析加樣緩沖液沖洗柱床?！　y定每一管的OD260，當洗出液中OD為0時，加入23倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。 　　加入1/10體積的3M NaAc()， ， 混勻， 20℃30分鐘?！　⌒⌒臈壢ド锨逡?，沉淀空氣干燥10分鐘，或真空干燥10分鐘。 　　[注意] mRNA在70%乙醇中70℃可保存一年以上。每次用前需用NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。 　　一、材料 　　提純TMV病毒液（10mg/ml）。 　　三、試劑 　　TE飽和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc()，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液，無RNA酶的雙菌水。　　吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有機相交界面無蛋白為止?！　∪∷啵尤?/10倍體積的3mol/L NaAc()，混勻，20℃30分鐘。　　小心棄去上清液，沉淀真空干燥5分鐘或空氣干燥10分鐘，并溶于無RNA酶的雙菌水或TE緩沖液中。 　　[注意] 整個操作應盡可能在低溫下進行。 第四節(jié) cDNA合成技術 　　一、 Riboclone MMLV(H ) cDNA合成技術 　　Promega公司的RibocloneR MMLV(H ) cDNA合成系統(tǒng)采用MMLV反轉錄酶的RNase H缺失突變株取代AMV反轉錄酶,使合成的cDNA更長。該系統(tǒng)試劑包括：　　20μg 特異性引物 　　200μl MMLV第一鏈緩沖液(5)，配方如下: 250mmol/L Tris 375mmol/l KCl。 50mmol/L DTT。Cl ,。 44mmol/L MgCl2。 。（一） 第一鏈合成 　　1. 試劑 　　[α32 P] dCTP (400Ci/mmol)，EDTA (50mM和200mM)，TE飽和酚:氯仿（1:1）， NH4Ac，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液。 　　(3) 37℃(隨機引物)或42℃(其它引物)溫浴1小時 　　(4) 取出置于冰上 　　(5) 摻入測定的eppendorf管加入95μl 50mM EDTA終止反應,并使總體積為100μl。 　　(6) 第一鏈合成eppendorf管可直接用于第二鏈合成 　　注：以上25μl反應總體積中所用RNA量為1μg,如合成5μg RNA,則可按比例擴大反應體積, 倒5μg RNA使用125μl總體積進行合成。 　　14℃溫浴2小時(如需合成長于3kb的cDNA, 則需延長至34小時)。 　　 cDNA第二鏈合成離心管反應液70℃處理10分鐘, 低速離心后置冰上。 　　加入10μl 200mmol/L EDTA終止反應?！　∷嘁浦亮硪籩ppendorf管,(,), (20℃), 20℃放置30分鐘后離心5分鐘。　　1 小心移去上清液,干燥沉淀?！　。ㄈ┩凰負饺敕派湫曰钚詼y定、計算和電泳分析 　　1. 試劑 　　1mg/ml鮭魚精DNA， 三氯乙酸(TCA, 5%和7%)，堿性瓊脂糖膠，堿性膠電泳緩沖液，（ 30mM NaOH，1mM EDTA），2樣品緩沖液，（20mM NaOH，20% 甘油，%溴酚藍）。 　　(2) 同樣各取3μl中反應液至含有100μl(1mg/ml)鮭魚精DNA中,混勻, 5% TCA, 渦旋混合儀混合后置冰上530分鐘。 　　(4) 分別測定總放射性活性強度和摻入放射性活性強度,可用蓋革計算器,也可用液閃計數(shù)。 　　4. 第二鏈產(chǎn)量計算　　除需去除第一鏈摻入dNTP外,方法同第一鏈產(chǎn)量計算 　　第二鏈摻入率= 摻入放射性活性/ 總放射性活性?? 　　摻入dNTP量(nnol)=[ dNTP/μl反應體積(μl)－第一鏈摻入nmol]第二鏈摻入率 　　第二鏈cDNA合成量(ng)=nmol dNTP330ng/nmol 　　雙鏈cDNA轉變率=雙鏈cDNA合成量(ng)/ 單鏈cDNA合成量(ng) 　　例: 第二鏈摻入放射性活性強度為2780cmp, 總放射性活性強度為235000cpm. 　　第二鏈摻入率=2780/235000100%=% 　　第二鏈合成dNTP量=[(100μl)－]% = 　　合成第二鏈cDNA量(ng)=330ng/nmol =155ng 　　雙鏈cDNA轉變率=155ng /158ng100%=98% 　　一般cDNA第一鏈轉變率和雙鏈轉變率以1250%和50200%為好。將第一鏈和第二鏈摻入測定管中的反應液先用酚抽提,乙醇沉淀，方法見本章（二）第二鏈合成中的912步，一般第一鏈和第二鏈上樣量相同。 　　2. 電泳分析 　　(1) 用50mM NaCl, 1mM %的堿性瓊脂糖電泳, 并置堿性電泳緩沖液中30分鐘。 　　(3) 加樣,電泳到染料距前沿線只剩膠長度的1/3處，電泳緩沖液為30mmol/L NaOH, 1mmol/L EDTA。 　　(5) 用保鮮膜包裹干燥的膠,室溫壓X光片(用增感屏時70℃壓片)。Cl,(42℃)。50mmol/L 　　MgCl2。 50mmol/L DTT。 　　50ml 40mM焦碳酸鈉 　　625m rRNasin RNA酶抑制劑 　　600m AMV反轉錄酶 　　5mg 　　200ml 10第二鏈緩沖液，配方如下： 　　400mmol/L Tris 900mmol/L KCl。 30mmol/L DTT。 　　2m RNaseH 　　500m PolymeraseⅠ 　　100m T4 DNA PolymeraseⅠ 　　 不含核酸酶的水 　　以上所有試劑除對照RNA需在70℃保存外，其余均可保存于20℃，可以合成40mgmRNA。 　?。▽otⅠ）和15m/mg. 　　試劑： 　　[a32P]dCTP（400ci/mmol)，EDTA(50mM和200mM)，TE飽和酶/氯仿， NH4Ac，100%和70%乙醇，TE緩沖液(10mM Tris 　　操作步驟： 　?。?）取一滅菌的無RNA酶的eppendorf管加入的RNA樣品，及引物或引物延接頭，（ NotⅠ引物延接頭/mg mRNA）的體積至15ml，70℃加熱5分鐘，待冷至室溫，離心數(shù)秒鐘使溶液集中在管底，然后依次加入： 　　　　5第一鏈緩沖液 5ml 　　　　rRNasinR RNA酶抑制劑 25ml 　　　　 　　　　AMV反轉錄酶 15m/mg RNA 　　　　加無水RNA酶水至總體積25ml 　　在加入焦碳酸鈉和AMV反轉錄酶前，需將反應液42℃溫浴5分鐘，以阻止焦碳酸鈉沉淀。 　　（2）輕彈eppendorf管，取出5ml至另一加于25m[a32P]dCTP c400ci/mmol）（其體積不能超過1ml），用以第一鏈同位素摻入放射性活性測定。 　?。?）取出置冰上?？扇?0ml進行電泳分析，另10ml進行同位素摻入測定。　?。ǘ┑诙満铣?　　第二鏈合成可在第一鏈合成反應液中直接進行。 第五章　重組質粒的連接、轉化及篩選第一節(jié) 概 述 　　質粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點。在質粒載體上進行克隆,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA和目的DNA片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質粒轉化細菌,即可完成。通過調整連接反應中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例,可以將載體的自身環(huán)化限制在一定程度之下,也可以進一步采取一些特殊的克隆策略,如載體去磷酸化等來最大限度的降低載體的自身環(huán)化,還可以利用遺傳學手段如α互補現(xiàn)象等來鑒別重組子和非重組子。也可在PCR擴增時，在DNA片段兩端人為加上不同酶切位點以便與載體相連。 由于質粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個相同粘性末端，因此在連接反應中外源片段和質粒載體DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個分子串連形成寡聚物, 而且正反兩種連接方向都可能有。還可將載體DNA的539。帶539。 　　帶有平末端 是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA聚合酶補平所致。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進DNA分子凝聚成聚集體的物質以提高轉化效率。凹端,使不相匹配的末端轉變?yōu)榛パa末端或轉為平末端后再進行連接。由于pBS上帶有Ampr 和lacZ基因,故重組子的篩選采用Amp抗性篩選與α互補現(xiàn)象篩選相結合的方法。而只帶有自身環(huán)化的外源片段的轉化子則不能存活。 　　pBS上帶有β半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和β半乳糖苷酶N端146個氨基酸的編碼序列。E. coli DH5α菌株帶有β半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。但在pBS和DH5α融為一體時可形成具有酶活性的蛋白質。由α互補產(chǎn)生的Lac+ 細菌較易識別，它在生色底物Xgal(5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代βD半乳糖苷)誘導形成藍色菌落。在麥康凱培養(yǎng)基上，α互補產(chǎn)生的Lac+細菌由于含β