【正文】 突變,而點(diǎn)突變位置正好是某些酶的識別和切割點(diǎn),可用酶切方法做出診斷.1. 點(diǎn)多態(tài)性 表現(xiàn)為DNA鏈中發(fā)生單堿基突變，且突變導(dǎo)致一個原有酶切位點(diǎn)的丟失或形成一個新的酶切位點(diǎn)。 n 2. 序列多態(tài)性 DNA鏈內(nèi)發(fā)生較大片段的缺失、重復(fù)、插入等變異。也可用Southern印跡雜交診斷相關(guān)疾病。具體地說就是將已知DNA片段或cDNA片段作為探針，緊密有序地排列固定于支持物（多聚賴氨酸硅膠）上，然后與熒光標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測每個探針分子雜交信號的強(qiáng)度，獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。同時設(shè)計探針時，突變堿基應(yīng)位于探針的中央，這樣在嚴(yán)格控制雜交和洗脫條件下，只有完全互補(bǔ)的探針保留下來，形成穩(wěn)定雜交分子，而中央堿基與靶序列不匹配的探針則被洗脫。Southern blot 檢測鐮狀細(xì)胞貧血，制備血液DNA MstII消化 瓊脂糖電泳 轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜 與標(biāo)記的珠蛋白DNA雜交 放射自顯影；PCR擴(kuò)增檢測 PCR擴(kuò)增珠蛋白基因 MstII消化 瓊脂糖電泳 EB染色例2：β地中海性貧血基因診斷（PCRASO）點(diǎn)突變，無限制性酶切位點(diǎn)改變，采用PCR結(jié)合等位基因特異性寡核苷酸探針雜交技術(shù) 已知突變Gene部位和性質(zhì)，合成寡核苷酸探針，32P標(biāo)記，進(jìn)行Southern Blot 雜交/斑點(diǎn)雜交。一個標(biāo)記在探針的 5‘ 端，稱為熒光報告基團(tuán)（ R ）；另一個標(biāo)記在探針的 3’ 端，稱為熒光抑制基團(tuán)（ 淬滅基團(tuán) Q ）。在探針分子完整的情況下， R 發(fā)出的熒光被 Q 淬滅吸收。當(dāng)特異性 PCR 擴(kuò)增發(fā)生時，探針會在 PCR 過程中被 Taq 酶的 5’3‘外切酶 活性作用切斷，釋放出R基團(tuán), Q的抑制作用消失，從而引起報告基團(tuán)熒光信號的產(chǎn)生,熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步 。 指紋圖譜法: ,因此電泳后在用標(biāo)記的小衛(wèi)星DNA做探針雜交時,不同個體出現(xiàn)不同的雜交帶型, ．高度的特異性 2 ． 穩(wěn)定的遺傳性： DNA 是人的遺傳物質(zhì)，其特征是由父母遺傳的。 3 ． 體細(xì)胞穩(wěn)定性：即同一個人的不同組織如血液、 肌肉、毛發(fā)、精液等產(chǎn)生的 DNA 指紋圖形完全一致。基因敲除技術(shù)（gene knockout)是指通過基因同源重組的過程定向的在活細(xì)胞中從基因組上移出特定基因的過程，從而建立基因剔除細(xì)胞和基因剔除生物。 間接基因治療：1基因增補(bǔ)：將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，不需將缺陷基因替換出來，只要目的基因在細(xì)胞中能夠表達(dá)，就達(dá)到了治療的目的。如血友病?；蚋深A(yù)的種類：反義RNA：封閉基因表達(dá)；核酶：裂解特異的靶mRNA；RNA干涉技術(shù)：這種反義RNA能與mRNA分子特異性地互補(bǔ)結(jié)合形成二聚體,從而阻止靶核酸的表達(dá)。RNA雜合分子中的RNA鏈， 在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達(dá)。 RNA干涉機(jī)制:外源dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后可激活Dicer(多種核酸 酶、解螺旋酶、RNA依賴的RNA聚合酶）,可以切割雙鏈RNA，雙鏈RNA再與Dicer形成沉默復(fù)合物(RISC)，RISC具有結(jié)合和切割mRNA的作用而介導(dǎo)RNA干涉的過程。 2個步驟：（1）長雙鏈RNA被細(xì)胞源性的雙鏈RNA特異的核酸酶(Dicer)切成2123個堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（small interfering RNA）（2）小干擾性RNA與細(xì)胞源性的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNAinduced silencing plex,RISC），該復(fù)合體可識別與小干擾性RNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點(diǎn)將該mRNA切斷 3 自殺基因治療:惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。 原理:將“自殺”基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生“自殺”效應(yīng)，從而達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。4基因免疫治療 通過將抗癌免疫增強(qiáng)細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤組織，以增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應(yīng)。 基因表達(dá)的檢測； 治療效果的體外研究； 建立動物模型； 治療效果的體內(nèi)研究； 藥代及藥理毒理研究； 中試研究； 申報及進(jìn)行臨床試驗； 擴(kuò)大規(guī)模進(jìn)行試生產(chǎn)；第十五章 分子生物學(xué)常用技術(shù)瓊脂糖凝膠凝膠電泳的基本原理：(1).核酸分子是兩性解離分子, 在pH ，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電荷，在一定的電場強(qiáng)度的電場中，它們會向正電極方向遷移；(2).電泳遷移率與分子的摩擦系數(shù)成反比，而摩擦系數(shù)又是分子大小、介質(zhì)粘度等的函數(shù)。影響電泳速度的因素：(一)顆粒自身因素 遷移率與顆粒表面電荷成正比，與介質(zhì)粘度及顆粒半徑成反比。(二). 影響電泳速度的外界因素 電場強(qiáng)度也稱電位梯度，是指單位長度（每一厘米）支持物體上的電位差，它對泳動速度起著十分重要的作用。 2 .溶液的pH值溶液的pH值決定了帶電顆粒解離的程度，決定了物質(zhì)所帶凈電荷的量和性質(zhì)。原因：帶電的離子會吸引相反符號的離子聚集在其周圍，相成一個與運(yùn)動粒子符號相反的離子氛（ionic atmosphere），它使該離子向相反的方向運(yùn)動，從而降低了該粒子的遷移率。 電泳過程中由于通電產(chǎn)生焦耳熱，熱對電泳有很大的影響。 對支持物的要求一般是均勻和吸附力小，否則電場強(qiáng)度不均勻，影響區(qū)帶的分離，實(shí)驗結(jié)果及掃描圖譜無法重復(fù)。遷移率：即單位電場強(qiáng)度粒子在電場中運(yùn)動的速度，取決于帶電粒子的電荷量、粒子大小和形狀。不連續(xù)凝膠電泳：是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩沖液、pH值和孔徑，不連續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨能力。分子雜交技術(shù)雜交（hydridization）指兩個以上的分子因具有相近的化學(xué)性質(zhì)(或結(jié)構(gòu)互補(bǔ))而在適宜的條件下特異地相互識別、結(jié)合形成雜交體（hybrid）的過程。 DNA復(fù)性 變性DNA只要消除變性條件，二條互補(bǔ)鏈還可以重新結(jié)合，恢復(fù)原來的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性。 核酸探針：是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記而便于檢測的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知DNA或RNA片段。cDNA探針是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子，是由逆轉(zhuǎn)錄酶催化而產(chǎn)生的。RNA探針：RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高,特異性強(qiáng)。寡核苷酸探針 根據(jù)已知的核酸序列，采用DNA合成儀合成一定長度的寡核苷酸片段，亦可作為探針使用。多用于克隆篩選和點(diǎn)突變分析。待測DNA樣品的制備、酶切；待測DNA 樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳；凝膠中DNA的變性：堿變性；Southern轉(zhuǎn)膜：硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜；探針的制備；Southern雜交；雜交結(jié)果的檢測Northern印跡雜交RNA + DNA /RNA雜交這是一種將待測RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印并固定到膜上、然后再與已知的DNA或RNA探針雜交的方法。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 基本原理：PCR技術(shù)實(shí)際上是在模板DNA，引物，和4種脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時就能將目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。PCR反應(yīng)條件: (1)．變性溫度與時間： 94℃ 3060 sec；(2)．退火(復(fù)性)溫度與時間： 40℃～60℃ 30～60sec；(3)．延伸溫度與時間：常用溫度為72℃；(4)．循環(huán)次數(shù): 25～40次。 1. 凝膠電泳分析：PCR產(chǎn)物電泳，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。2. 酶切分析：根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶切、獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，還能進(jìn)行變異性研究。4. 核酸序列分析：是檢測PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法DNA序列測定 Sanger雙脫氧鏈終止法原理 在DNA復(fù)制反應(yīng)中加入ddNTP，ddNTP不能形成3,5磷酸二酯鍵，具有阻斷DNA復(fù)制的作用。將制得的四組混合物全部平行地點(diǎn)加在變性聚丙烯酸受凝膠電泳板上進(jìn)行電泳，每組制品中的各個組分將按其鏈長的不同得到分離，根據(jù)放射自顯影圖譜，從不同的分組和電泳條帶的順序，可以直接讀出待測DNA片段的核苷酸序列。該陣列與標(biāo)記的核酸雜交后，能在短時間快速，準(zhǔn)確地獲取大量信息。（一）反義（antisense）技術(shù) 反義RNA：指根據(jù)RNA序列人工合成的互補(bǔ)RNA。反義DNA： 與特定DNA 或RNA互補(bǔ)結(jié)合，在 DNA和RNA水平抑制特定基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。 核酶： 具有酶活性的RNA，參與RNA的加工和成熟。（二）RNA干涉（RNA interference, RNAi）：由短雙鏈RNA（2123nt）誘導(dǎo)的同源RNA降解的過程。 發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS), 是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的一種現(xiàn)象。RISC與基因表達(dá)的mRNA的同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功能，在siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端切割mRNA。siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA， 可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNAdependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用進(jìn)一步放大，最終將靶mRNA完全降解。它比基因敲除技術(shù)(knockout)更為便捷, (3) 特異高: RNAi能特異性降解mRNA單個堿基的改變即可使RNAi失效。 RNAi具有一定的可遺傳性。 結(jié)構(gòu)基因組學(xué): 是以全基因組為研究對象,進(jìn)行基因作圖、序列分析、基因鑒定，確定染色體全基因組DNA序列、所含基因的位置及其結(jié)構(gòu)和相互關(guān)系，為闡明基因功能奠定基礎(chǔ)。即通過計算遺傳標(biāo)記的重組率，以重組率的大小反映遺傳標(biāo)志間的相對距離繪制遺傳圖譜（1厘摩表示重組率為1％）。位點(diǎn)距離用bp表示。序列圖譜（sequence map）是人類基因組的全部核苷酸的排列順序。DNA分子帶有負(fù)電荷，會朝正極移動。因此,小分子向前移動的速度比大分子快。DNA鏈末端合成終止法DNA自動測序 毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE) 帶電粒子在電場作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象稱電泳。帶電粒子在毛細(xì)管內(nèi)電解質(zhì)溶液中的遷移速度等于電泳和電滲流(EOF)二者的矢量和。 生物信息學(xué)(bioinformatics)是利用計算機(jī)貯存原始資料，分析生物信息，,收集、加工和處理生物資料。后基因組學(xué)主要利用DNA微列陣技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)、酵母菌雙雜交系統(tǒng)以及生物信息學(xué)等技術(shù)相結(jié)合，對已知的基因組序列進(jìn)行研究第十七章 蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組是指一個基因組、一種生物、一種細(xì)胞或組織所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)。一向：等電聚焦電泳 蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。等電聚焦電泳的原理 在聚丙烯酰胺凝膠中加入兩性電解質(zhì)載體,使其在電場中形成一個連續(xù)且穩(wěn)定的線性或非線性的pH梯度,使pH從凝膠的正極向負(fù)極依次遞增,電泳時被分離的蛋白質(zhì)在偏離等電點(diǎn)的pH位置時，因帶有電荷而移動,. 二向：SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 原理: 蛋白質(zhì)在電泳時，它的遷移率取決于它所帶靜電荷的多少以及分子的大小和形狀等因素。SDS使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，使蛋白質(zhì)在水中的形狀呈橢圓形，只是大小不同。這樣蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而是取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。v 生物分子信息的特征生物分子信息數(shù)據(jù)量大 v 生物分子信息復(fù)雜 v 生物分子信息之間存在著密切的聯(lián)系??18 / 18