【正文】 ～5 min后，將儀器設在暫停，在這一高溫條件下迅速加入耐熱DNA聚合酶后再恢復循環(huán)?！　∷?、PCR技術的主要用途1. 目的基因的克隆　PCR技術為在重組DNA過程中獲得的目的基因片段提供了簡便快速的擴增方法。2. 基因的體外突變　利用PCR技術可以隨意設計引物在體外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突變等改造。從理論上講，只要存在1分子模板，就可以獲得目的片段。因此，PCR在基因診斷方面具有極廣闊的應用價值。待測DNA片段既可以克隆到特定的載體后進行序列測定，也可直接測定。利用PCR與一些技術的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性?，F(xiàn)僅舉幾例介紹與醫(yī)學研究密切相關的PCR衍生技術。即首先以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，然后再以cDNA為模板通過PCR反應來擴增目的基因。2. 原位PCR技術　原位PCR（in situ PCR, ISP）是在福爾馬林固定、石蠟包埋的組織切片或細胞涂片上的單個細胞內(nèi)進行的PCR反應，然后用特異性探針進行原位雜交，即可檢出待測DNA或RNA是否在該組織或細胞中存在。3. 實時PCR技術　實時PCR（real time PCR）技術是近年發(fā)展起來的一種新的核酸微量分析技術，尤其是在定量RTPCR中具有重要的價值。根據(jù)動態(tài)變化數(shù)據(jù)，可以精確計算出樣品中原有模板的含量。與傳統(tǒng)PCR反應相比，在常規(guī)的正向和反向PCR引物之間增加了一對特殊的引物作為探針，探針的539。端有一個熒光淬滅分子（quencher, Q）。隨著PCR的進行，Taq DNA聚合酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合著的熒光探針，其5′→3′外切核酸酶活性就會將該探針逐步切斷，報告熒光基團一旦與淬滅基團分離，便產(chǎn)生熒光信號。實時PCR技術實現(xiàn)了PCR反應從定性到定量的飛躍，目前已逐步得到廣泛的應用。 一、目的基因的獲得目的基因是指所要研究或應用的基因，也就是將要克隆或表達的基因。目前用于獲得目的基因的方法有幾種，如限制性內(nèi)切酶直接分離法、文庫篩選法、體外擴增法和人工合成法等，其中限制性內(nèi)切酶法直接分離目的基因和多聚酶鏈式反應（PCR）或逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應（RTPCR）體外擴增目的DNA片段是目前最常用的方法。2. 從真核基因組中制備　真核基因組比較大，直接用限制性內(nèi)切酶消化后需要篩選的克隆數(shù)太多，不易操作。我們也可以將酶切后的基因組DNA片段全部克隆入適當?shù)妮d體中，制成基因組文庫，再用特異性探針與基因組文庫中的不同克隆進行雜交，陽性克隆即表示克隆到的DNA片段含有特異基因序列。這樣一步步走下去，最終可得全部基因序列，這種技術叫做染色體步移（chromosome walking）。利用PCR獲取目的基因的一大優(yōu)點就是可以根據(jù)需要在引物序列上設計適當?shù)拿盖形稽c、起始密碼子或終止密碼子等，或通過人為錯配改變堿基序列（人工突變）對目的基因進行有限修飾。這種方法的優(yōu)點是可以將表達水平很低的mRNA擴增出來，有利于篩選出表達豐度低的基因。還有一個獲得目的基因的方法是利用計算機技術進行“計算機克隆”，即利用GenBank中的基因信息，通過軟件比較不同種屬基因之間的相似性（同源性），利用保守區(qū)序列設計引物，再用PCR或RTPCR從不同種屬或不同組織細胞中獲取未知的基因片段。（三）基因組文庫或cDNA文庫的構(gòu)建和篩選將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶消化后插入到適當載體中，得到含有不同插入片段的克隆載體，這種克隆載體的混合物含有長短不同的基因組片段，這就是基因文庫。目前許多組織或細胞的基因組或cDNA文庫都可以從商業(yè)公司買到。基因組文庫或cDNA文庫的構(gòu)建和使用請參見本書相應的章節(jié)。化學合成法可以改變原始的基因序列，甚至可以合成自然界不存在的序列?！　《⒛康幕蚝洼d體的連接獲得目的基因后必須將其放在一定的載體內(nèi)才能在宿主細胞內(nèi)擴增或表達。由于目前很多基因都是利用PCR技術獲得，因此這里先介紹PCR產(chǎn)物的克隆策略，然后再介紹其他的克隆方式。無論研究的起始材料是RNA還是DNA，最重要的是要有一種有效的方法對PCR產(chǎn)物進行克隆。1. 限制性內(nèi)切酶酶切位點添加法　對PCR產(chǎn)物進行克隆的一個基本方法是利用目的片段所特有的限制性內(nèi)切酶識別位點對產(chǎn)物進行酶切消化。設計PCR引物時必須考慮以下幾個因素：①如果PCR產(chǎn)物序列未知，那么在引物上所提供的位點有可能會出現(xiàn)在產(chǎn)物DNA中，使用這些位點進行酶切時將會導致產(chǎn)物內(nèi)部切割，產(chǎn)生缺失的克隆?？捎肒lenow酶、T4多聚核苷酸激酶及T4 DNA連接酶等處理PCR產(chǎn)物來克服這一缺陷：首先用激酶對PCR產(chǎn)物進行處理，然后將PCR產(chǎn)物分子上的突出末端用Klenow酶補平，再用T4 DNA連接酶進行連接，形成由多個PCR產(chǎn)物組成的串聯(lián)體，這種多聚體能被所采用的內(nèi)切酶有效地切割。突出端的線性化載體與帶有單個腺苷酸（A）339。它利用了Taq DNA聚合酶具有延伸酶活性，即以不依賴模板的方式將一個核苷酸添加到已完成延伸的PCR產(chǎn)物的339。對于多數(shù)DNA聚合酶，這個添加上去的核苷酸通常是A殘基。端帶有單個T突出末端的線性化載體，分別是MboII、XcmI和HphI。T突出端的載體，一種是將一個T殘基加到經(jīng)過限制性內(nèi)切酶線性化處理后產(chǎn)生平端的載體上，或者利用末端轉(zhuǎn)移酶加上一個雙脫氧胸腺嘧啶三磷酸（ddTTP）；另一種方法則是利用Taq DNA聚合酶具有的延伸酶活性，將一個A殘基加到DNA模板的339。為了在339。只能加上一個T殘基。（二）外源DNA片段和載體的連接1. 黏性末端的連接　用一種適當?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶將目的基因和載體DNA消化，使它們兩端各具有相同的黏性末端，兩者的互補末端堿基配對，在DNA連接酶作用下，共價連接成新的DNA分子。為了減少和防止這種情況的發(fā)生，需用高濃度的外源DNA（插入片段與載體的比率一般為3:1），并用堿性磷酸酶將載體上的539。②不能定向插入。（2）雙酶切的黏性末端間的連接：用兩種限制性內(nèi)切酶消化載體和外源DNA片段，因黏性末端不同，載體分子和外源DNA片段只能按一種方向連接，這就是所謂“定向克隆”。有幾種方法可提高平端連接的連接效率：①在連接反應中使目的基因片段分子數(shù)大大過量；②用堿性磷酸酶對載體進行處理，去除載體兩端的539?！　∪?、重組分子的擴增和鑒定（一）重組DNA分子導入受體細胞目的基因和載體在體外連接形成重組DNA分子后，需要被導入受體細胞中才能進行增殖和（或）表達。受體細胞分為原核細胞（如大腸桿菌）和真核細胞（如酵母、昆蟲細胞及哺乳動物細胞）。受體細胞是重組基因增殖的場所，所以對受體細胞也應具有幾點要求：①容易接納重組DNA分子；②對載體的復制擴增無嚴格限制；③不存在特異的能降解外源DNA的內(nèi)切酶體；④不對外源DNA進行修飾。一般將重組DNA分子導入原核細胞的過程稱為轉(zhuǎn)化（transformation），而導入真核細胞的過程稱為轉(zhuǎn)染（transfection）。將重組DNA分子和感受態(tài)大腸桿菌細胞相混合，使重組DNA分子進入大腸桿菌中，就可以實現(xiàn)重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。1. 抗生素篩選　可根據(jù)所選用載體的特性，尤其是抗藥基因的存在與否進行初步篩選。但這種篩選并不能說明目的基因一定連接到了載體上。2. Xgal篩選　有些載體為了方便篩選，根據(jù)細菌乳糖操縱子原理，將LacZ基因構(gòu)建到了載體的多克隆酶切位點處。根據(jù)這種特性，可以基本判斷重組成功與否。如果目的基因被成功地插入到了載體分子中，可以通過目的基因兩端的酶切位點將目的基因切割下來，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳即可以判斷目的基因的存在與否，這是簡便而常用的鑒定方法。有關DNA序列分析技術將在有關章節(jié)詳細敘述。5. 其他方法　如采用核酸分子雜交或菌落原位雜交鑒定重組DNA分子，或采用蛋白印跡方法直接檢測目的蛋白的表達