分子生物學(xué)要點-閱讀頁
2025-04-22 03:17本頁面
【正文】 火，然后耐熱DNA聚合酶以dNTP為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈 DNA。需要重復(fù)進(jìn)行DNA模板解鏈、引物與模板DNA結(jié)合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即 高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個步驟構(gòu)成PCR反應(yīng)的一個循環(huán)，此循環(huán)的反復(fù)進(jìn)行，就可使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。單 鏈DNA，94℃。雜交鏈，引物的Tm值。新合成的引物延伸鏈 經(jīng)過變性后又可作為下一輪循環(huán)反應(yīng)的模板PCR，就是如此反復(fù)循環(huán)，使目的DNA得到高效快速擴(kuò)增。過短影響PCR的特異性，過長會提高相應(yīng)退火溫度，使延伸溫度超過TaqDNA聚合酶最適溫度74℃,影響產(chǎn)物的生成。3’端不應(yīng)有連續(xù)3個G和C。G+C含量一般占45％ 55％。引物的連續(xù)互補序列，一般不超過3bp。引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不超過70％，引物3’末端連續(xù)8個堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。引物3’端最佳堿基選擇是G和C，形成的堿基配對比較穩(wěn)定。引物的5’端可以修飾，如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列包括起始密碼子、終止密碼子等。 l TrisHCl緩沖液 lKCl 促進(jìn)引物的退火，濃度太高時會抑制Taq DNA聚合酶活性。 必要時加入適量二甲基亞砜(DMSO)或甲酰胺利于破壞模板二級結(jié)構(gòu)，提高PCR反應(yīng)特異性。Mg 2+濃度過低，會顯著降低酶活性。Mg 2+濃度還會影響引物的退火、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，從而影響擴(kuò)增片段的產(chǎn)率。 降低濃度會導(dǎo)致反應(yīng)速度下降，可提高反應(yīng)的特異性。Taq DNA聚合酶 7580℃時具有最高的聚合酶活性，150個核苷酸/秒；具有良好的熱穩(wěn)定性，95℃仍有活性。引物濃度偏高會引起錯配或非特異性擴(kuò)增、生成引物二聚體，使目的DNA片段產(chǎn)率下降。（二十）、大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)外源基因必須具備的條件？答:要求外源基因的編碼區(qū)不能含有內(nèi)含子；表達(dá)的外源片段要位于大腸桿菌啟動子的下游，并形成正確的閱讀框架；轉(zhuǎn)錄出的mRNA必須有與大腸桿菌16S rRNA3，末端相匹配的SD序列，才能被有效的翻譯成蛋白質(zhì)。（二十一）、真核細(xì)胞表達(dá)外源基因的條件？答:首先必須具備哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的功能元件。（二十二）、轉(zhuǎn)基因動物的概念、原理及應(yīng)用？答:概念:是指用人工方法將外源基因?qū)牖蛘系交蚪M內(nèi)，并能穩(wěn)定傳代的一類動物。 基本原理:將目的基因或基因組片段用顯微注射等方法注入實驗動物的受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞中，使目的基因整合到基因組中，然后將此受精卵或著床前的胚胎 細(xì)胞再植入受體動物的輸卵管或子宮中，使其發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動物，人們可以通過分析轉(zhuǎn)基因和動物表型的關(guān)系，揭示外源基因的功能；也可以通過 轉(zhuǎn)入外源基因培育優(yōu)良的動物品種。（二十三）、基因敲除的基本程序？答:通過DNA同源重組，使得胚胎干細(xì)胞特定的內(nèi)源基因被破壞而造成功能喪失，然后通過胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)得到該基因喪失的小鼠模型的過程稱為基因敲除。 胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng) 打靶載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞 同源重組胚胎干細(xì)胞的篩選 基因敲除胚胎干細(xì)胞注射入胚泡 胚泡植入假孕小鼠的子宮中 雜交育種獲得純合的基因敲除動物（二十四）、DNA芯片的原理？答DNA芯片技術(shù)就是一種大規(guī)模的集成的固相核酸分子雜交，以大量已知堿基序列的寡核苷酸片段為探針，檢測樣品中哪些核酸序列與其互補，然后通過定性定量分析得出待測樣品的基因序列及表達(dá)的信息。（二十五）、誘變劑的作用機(jī)制？答:堿基的類似物誘發(fā)突變改變DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)結(jié)合到DNA分子上誘發(fā)移碼突變紫外線及其他射線引起的DNA分子的變化（二十六）、突變類型及其遺傳效應(yīng)？答:突變類型:① 點突變DNA大分子上一個堿基的變異。②缺失:一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。④ 倒位DNA鏈內(nèi)重組，使其中一段方向倒置。③ 蛋白質(zhì)肽鏈中的片段缺失:（二十七）、基因治療的策略？答:基因置換或稱基因矯正:特定的目的基因?qū)胩囟ǖ募?xì)胞，通過定位重組，讓導(dǎo)入的正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原有的缺陷基因，不涉及基因組的任何改變?；蚋深A(yù):采用特定的方式抑制某個基因的表達(dá)，或者通過破壞某個基因而使之不能表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。（二十八）、基因診斷常用的生物學(xué)技術(shù)。：是指數(shù)個功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，構(gòu)成信息區(qū)，連同其上游的調(diào)控區(qū)（包括啟動子和操縱基因）以及下游的轉(zhuǎn)錄終止信號所構(gòu)成的基因表達(dá)單位，所轉(zhuǎn)錄的RNA為多順反子。：是指那些與結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)、能夠被基因調(diào)控蛋白特異性識別和結(jié)合的特異DNA序列。：是指真核細(xì)胞內(nèi)含有的大量可以通過直接或間接結(jié)合順式作用元件和RNA聚合酶而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)因子。：在原核生物的mRNA上的其實密碼子AUG上游方向413核苷酸之前有一段富含嘌呤的序列，稱SD序列。：是大腸桿菌分解代謝物基因活化蛋白，這種蛋白可將葡萄糖饑餓信號傳遞個許多操縱子，使細(xì)菌在缺 乏葡萄糖時可以利用其他碳源。：DNA復(fù)制合成滯后鏈時首先合成的DNA片段稱為岡崎片段。逆轉(zhuǎn)錄在病毒致癌過程中起著重要的作用；在基因工程中，可用于mRNA為模板合成cDNA的實驗中。真核生物有多個復(fù)制起點，為多復(fù)制子；原核生物只有一個復(fù)制起點，為單復(fù)制子?！ p色效應(yīng)：加熱變性了的核酸分子，在退火條件下發(fā)生復(fù)性時，其在260nm處的紫外吸收值減少的現(xiàn)象稱減色效應(yīng)?！ ∩莩藁颍褐辉谀程囟ǖ募?xì)胞類型中表達(dá)的基因稱奢侈基因。：指細(xì)胞內(nèi)某些特定基因的拷貝數(shù)專一性的大量增加的現(xiàn)象。 副密碼子：tRNA分子上的決定其攜帶氨基酸種類的區(qū)域，與mRNA上的密碼子的堿基互補，存在于三葉草結(jié)構(gòu)的反密碼環(huán)上。１）染色體方面： 原核生物為環(huán)狀DNA分子，且DNA裸露或結(jié)合少量蛋白質(zhì)，只有一個基因連鎖群； 真核生物為線性雙鏈DNA分子，且DNA同組蛋白和非組蛋白結(jié)合，有2個以上基因連鎖群。３）轉(zhuǎn)錄單元： 原核生物為多順反子，真核生物為單順反子，基因家族。５）基因表達(dá)： 原核生物RNA和蛋白質(zhì)在同一區(qū)間合成，有重疊基因；真核生物RNA在核中合成和加工，蛋白質(zhì)在細(xì)胞中合成，有斷裂基因24 / 24
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