【正文】 ）PCR反應(yīng)擴(kuò)增基因；2）平末端加A尾，用于TA克隆 二十、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中外源基因表達(dá)的條件及影響因素（條件優(yōu)化） 1）應(yīng)選用大腸桿菌表達(dá)載體。 2）來自真核細(xì)胞的目的基因要適當(dāng)改造。 3）目的基因與載體可以按不同方式連接。表達(dá)融合蛋白時可將目的基因連接于原核基因編碼序列。 1）選擇可調(diào)控的強(qiáng)啟動子； 2）引入原核增強(qiáng)子樣序列； 3）設(shè)計(jì)合理的SD序列并調(diào)整SD序列與ATG之間的距離，增強(qiáng)核糖體和mRNA的結(jié)合程度； 4）使用大腸桿菌優(yōu)勢密碼子或共表達(dá)稀有密碼子的tRNA基因； 17 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 5）增加mRNA的穩(wěn)定性，5’端加入“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，3’端加入重復(fù)性基因外回文序列（REP）； 6）提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性：①分泌表達(dá)；②與細(xì)菌固有蛋白融合表達(dá)；③改造蛋白酶識別位點(diǎn)；④使用蛋白酶基因缺陷細(xì)菌；⑤共表達(dá)蛋白穩(wěn)定輔助因子（HSP、分子伴侶基因等） 二十一、良好載體的條件 （DNA聚合酶識別位點(diǎn)），能在宿主細(xì)胞內(nèi)攜帶外源基因一同復(fù)制； （MCS），以供外源DNA插入； ，以區(qū)別陽性和陰性重組子； ； ； 。 ：1）只能整合到分裂相的細(xì)胞；2）容量?。ú怀^10kb）；3）病毒滴度不高；4）隨機(jī)整合，有激活癌基因的潛在危險。 ：1）是非病原微生物,未發(fā)現(xiàn)野生型AAV與人類疾病有關(guān)。 ：1）只能包裝小于5kb的目的基因片段，相對轉(zhuǎn)基因能力受限；2）整合時需要輔助病毒感染才能進(jìn)行復(fù)制，增加包裝的難度；3）很難大量生產(chǎn)；4）感染效率較逆轉(zhuǎn)錄病毒低；5）40％～80％成人人感染過該病毒，可能會引起免疫排斥。 AAV載體能轉(zhuǎn)染非分裂期細(xì)胞和持久表達(dá)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的特點(diǎn),適用于人造血干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染，用于治療血液系統(tǒng)疾病。 二十四、基因功能分析的三大策略 特定基因功能研究的基本策略：通過特定基因的導(dǎo)入和特定基因的剔除或表達(dá)的抑制，制備模式生物體或體外培養(yǎng)的細(xì)胞模型，觀察和檢測其表型（包括整體、細(xì)胞、分子水平）的變化，從而分析、鑒定特定基因的功能。如轉(zhuǎn)基因動物、基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞等。 1. 轉(zhuǎn)基因模型的應(yīng)用 1）利用轉(zhuǎn)基因動物分析特定基因功能：①確定特定基因的功能；②發(fā)現(xiàn)新的基因功能或未知基因的功能；③發(fā)現(xiàn)新基因（突變）；④研究基因表達(dá)的時空性；⑤建立外源基因表達(dá)、調(diào)控的動物模型；⑥產(chǎn)生需要的器官或組織；⑦用于只在胚胎期表達(dá)的基因結(jié)構(gòu)和功能的研究。也可將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞植入生物體內(nèi)，研究基因的功能。①可用于觀察特定基因在整體上的功能是否唯一，或可被其他基因替代；②一些胚胎發(fā)育期的重要基因多采用條件性基因敲除模型進(jìn)行研究；③可用于推斷基因在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用 3. 基因表達(dá)的抑制或沉默 基因表達(dá)的抑制或沉默是通過在RNA水平的干涉來分析特定基因功能的方法。原理：雙鏈RNA 激活Dicer（ 酶復(fù)合物，由核酸內(nèi)切酶和解旋酶組成），識別異常的雙鏈RNA并將其切割成短雙鏈RNA（siRNA，2123bp）， siRNA與Dicer結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）， 19 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 雙鏈RNA經(jīng)解旋酶作用，成為單鏈RNA，識別并結(jié)合靶RNA分子，致核酸內(nèi)切酶的切割，失去編碼蛋白質(zhì)的功能。 ：1）顯微注射法；2）逆轉(zhuǎn)錄病毒感染；3）精子載體法 二十六、基因診斷常用的技術(shù) (PCR) （RFLP） (SSCP) 二十七、基因診斷的特點(diǎn) ：因?yàn)榛蛲蛔兒屯庠粗虏』虼嬖谑羌膊∽钤急举|(zhì)的因素，所有基因診斷的特異性可高達(dá)100％； ：檢測靈敏度達(dá)pg水平，樣品使用量少； ，穩(wěn)定性好：任一有核細(xì)胞均可作為檢測樣本，如：血液、精子、唾液、尿液、毛發(fā)、牙齒等。 20 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 二十八、基因診斷的策略 ，發(fā)病機(jī)制已知→直接檢測致病基因； ，發(fā)病機(jī)制未明，但致病基因已定位于染色體或基因組特定區(qū)域→檢測致病基因的連鎖遺傳標(biāo)記； 、多基因?。ǜ哐獕?、腫瘤等）→檢測表型克?。簩膊∠嚓P(guān)一組基因克隆制作探針進(jìn)行診斷，不受基因作用及相互作用方式影響。 二十九、基因治療的策略 ：特定的目的基因?qū)胩囟ǖ募?xì)胞，通過定位重組，讓導(dǎo)入的正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原有的缺陷基因，不涉及基因組的任何改變。 ：采用特定的方式抑制某個基因的表達(dá)，或者通過破壞某個基因而使之不能表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。 －－改變細(xì)胞功能：如基因修飾腫瘤細(xì)胞的“疫苗”療法、基因修飾TIL的過繼免疫方法、免疫增強(qiáng)基因療法、原位修飾腫瘤免疫原性的基因療法。 三十、基因置換或基因添加的必要條件 ； ； ； ； ； 三十一、轉(zhuǎn)基因靶細(xì)胞的選擇 ； ，且生命周期較長； 21 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） ； ； ：造血細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等。 三十三、哪些疾病可用基因治療 1）在DNA水平明確其發(fā)病原因及機(jī)制； 2）必須是單基因遺傳病，而且屬隱性遺傳； 3）該基因的表達(dá)不需要精確調(diào)控； 4）該基因能在一種便于臨床操作的組織細(xì)胞中表達(dá)并發(fā)揮其生理作用； 5）該遺傳病不經(jīng)治療將有嚴(yán)重后果。 （常用方法：①基因干預(yù)技術(shù)：反義RNA、RNA干擾、反義基因；②自殺基因治療；③免疫基因治療：細(xì)胞因子基因治療、MHC基因治療；④提高化療效果的輔助基因治療：藥物增敏、耐藥基 22 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 因的相關(guān)治療；⑤聯(lián)合基因治療：自殺基因、免疫因子基因、抑癌基因、自殺基因與細(xì)胞因子基因、抑癌基因與免疫因子基因。 三十四、PCR原理及影響因素 原理：PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理是依據(jù)細(xì)胞內(nèi)的DNA半保留復(fù)制的機(jī)理，以及體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以相互轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，然后耐熱的DNA聚合酶以dNTP為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。需要重復(fù)進(jìn)行DNA模板解鏈、引物與模板結(jié)合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個步驟構(gòu)成PCR反應(yīng)的一個循環(huán)，此循環(huán)反復(fù)進(jìn)行，就可以使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。過短影響PCR的特異性，過長會提高相應(yīng)的退火溫度，使延伸溫度會超過Taq DNA聚合酶的最適溫度（74℃），影響產(chǎn)物的生成。 ③引物堿基：G+C含量以4060%為宜， G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶；堿基最好隨機(jī)分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3′端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因?yàn)檫@樣會使引物在G+C富集區(qū)引發(fā)錯誤延伸 ④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)和引物間互補(bǔ)，特別避免 3’端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增條帶。 ⑥引物5′端可修飾,引物5′端限定著PCR產(chǎn)物的長度，但對擴(kuò)增特 異性影響不大； 23 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 引物5′端堿基可不與模板DNA互補(bǔ)而呈游離狀態(tài)；引物5′端最多可加10個堿基而對PCR反應(yīng)無影響。 ⑧引物量：～～100 pmol以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。一個典型的 PCR反應(yīng)約需酶量1 ，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增， 濃度過低會降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。降低濃度可導(dǎo)致反應(yīng)速度減慢，可提高反應(yīng)的特異性，但過低會影響PCR產(chǎn)量。 5. 模板DNA的濃度： ～2ug/，模板DNA濃度過高導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物增加。退火時間一般為30～60s，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。 三十五、Sanger法原理 DNA鏈中核苷酸以3’,5’磷酸二酯鍵連接，合成DNA所用的底物是 2’脫氧核苷三磷酸。在DNA聚合酶作用下通過三磷酸基團(tuán)摻入到延伸的DNA鏈中，但由于沒有3’羥基，不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，正在延伸的DNA鏈不能繼續(xù)延伸。在4組獨(dú)立酶反應(yīng)中分別采用4種不同的ddNTP，結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的A、C、G或T位置。 24 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 三十六、Westen blot法原理 首先將混合的的蛋白質(zhì)用聚丙烯酰胺凝膠電泳按大小分開，再通過電轉(zhuǎn)移將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜或其他膜上。 三十七、核酸分子雜交的原理 具有一定同源性的兩條核酸單鏈（DNA/RNA）在適宜條件下（溫度及離子強(qiáng)度）可以按堿基互補(bǔ)配對原則退火形成雙鏈分子，由此可以檢測核酸分子存在與否。 三十八、核酸分子雜交的影響因素 ：濃度高，復(fù)性快，長度50～300堿基為宜； ：過高不利復(fù)性，過低局部雙鏈不易解離，適宜溫度為Tm25℃左右； ：雜交率隨離子強(qiáng)度增加而增加，不完全同源核酸分子雜交時可以選擇高鹽，高度同源核酸序列雜交可以在高溫、低鹽條件下進(jìn)行。 三十九、核酸探針標(biāo)記的方法 ：利用適當(dāng)濃度DNaseⅠ在DNA雙鏈上隨機(jī)切割單鏈，形成單鏈缺口。 ：常用的隨機(jī)引物是六核苷酸片段混合物，這些分子在每個位置上都有可能有含有所有4種堿基的組合，因此可以與任意核苷酸序列互補(bǔ)，作為DNA擴(kuò)增的引物。 25 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） ：在帶有RNA聚合酶識別的啟動子的人工載體的啟動子下游插入目的基因，再在插入序列下游切口質(zhì)粒使其線性化，在一種標(biāo)記NTP和3種未標(biāo)記NTPs存在下，特異RNA聚合酶可將目的基因的DNA轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的RNA探針。 ：在反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA反應(yīng)中，加入標(biāo)記核苷酸合成cDNA探針，可選用特異的寡核苷酸引物、隨機(jī)引物或oligo dT引物。 ：在PCR反應(yīng)體系中將一種dNTP換成標(biāo)記的dNTP，合成特異的DNA探針。 優(yōu)點(diǎn)：無內(nèi)含子和重復(fù)序列。 ：從基因組文庫篩選得到特定基因或基因片段的克隆后擴(kuò)增、純化，切取插入片段后分離純化為探針。缺點(diǎn)：探針可能存在高度重復(fù)序列，引起假陽性。 優(yōu)點(diǎn)：可根據(jù)需要合成相應(yīng)序列；片段長度短，受Tm影響大，特別適合基因突變分析；序列復(fù)雜性低，雜交時間短。 ：采用基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄的方法可得到RNA或反義RNA探針。缺點(diǎn)：含ployA尾；易降解不易操作；來源極不方便。 ：反義RNA抗RNase的能力不強(qiáng)，注射到體內(nèi)容易被降 26 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 解，殘余的少量反義RNA分布全身，無法得到很好的調(diào)節(jié)效果。由于受體配體結(jié)合的特異性，將特定配體改造為轉(zhuǎn)運(yùn)反義RNA的工具，可高效、專一的轉(zhuǎn)移反義RNA。2）對反義RNA進(jìn)行些修飾，如用硫代磷酸核苷替代通常的核苷酸可以提高抗降解的能力；3）設(shè)計(jì)可調(diào)控表達(dá)反義RNA片段的質(zhì)粒。 機(jī)制：雙鏈RNA 激活Dicer（ 酶復(fù)合物，由核酸內(nèi)切酶和解旋酶組成），識別異常的雙鏈RNA并將其切割成短雙鏈RNA（siRNA，2123bp）， siRNA與Dicer結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC），雙鏈RNA經(jīng)解旋酶作用，成為單鏈RNA，識別并結(jié)合靶RNA分子，致核酸內(nèi)切酶的切割，失去編碼蛋白質(zhì)的功能。 。這些位點(diǎn)上如果沒有插入外源DNA片段，在質(zhì)粒被導(dǎo)入攜帶lacZ基因C端編碼區(qū)的大腸桿菌后，質(zhì)粒攜帶的lacZ基因片段（N端）將正常表達(dá)，與大腸桿菌的lacZ基因產(chǎn)物互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的β半乳糖苷酶，加入人工底物Xgal和誘導(dǎo)劑IPTG后，使Xgal轉(zhuǎn)化成藍(lán)色的代謝產(chǎn)物，出現(xiàn)藍(lán)色菌落?？捎糜诤Y選重組克隆和非重組克隆，稱為籃白篩選