【正文】 期及晚期，Cyclin DCdk4/6和Cyclin ECdk2先后磷酸化RB。 十七、抑癌基因在細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制與腫瘤發(fā)生機(jī)制之間的關(guān)系 ：RB的作用機(jī)制是通過與轉(zhuǎn)錄因子E2FDP1結(jié)合，控制細(xì)胞無法通過G1S關(guān)卡。M期的cyclinA/BCdk1可使結(jié)合在紡錘體處的APC磷酸化而活化，最終導(dǎo)致連接染色體的蛋白質(zhì)降解。 ③細(xì)胞進(jìn)入M期→MPF（促有絲分裂因子，即cyclinBCdk1）激活分裂后期促進(jìn)復(fù)合體（APC）→分裂抑制因子泛素化而降解→姐妹染色體分離→ APC促進(jìn)cyclin B降解→細(xì)胞核重形成，胞質(zhì)分裂，產(chǎn)生兩個(gè)子代細(xì)胞。 ①G1后期開始表達(dá)cyclin B，cyclin B與Cdk1結(jié)合，在G2M轉(zhuǎn)折處，Cdk1被磷酸酶Cdc25C 去磷酸化而活化cyclinBCdk1,導(dǎo)致底物蛋白（組蛋白核纖層蛋白等）的磷酸化，細(xì)胞通過G2M關(guān)卡。進(jìn)入S期的細(xì)胞開始表達(dá)cyclin A并結(jié)合活化Cdk2，啟動(dòng)DNA復(fù)制。P53可通過促進(jìn)細(xì)胞周期抑制物p21蛋白的表達(dá)，阻止受損細(xì)胞通過G1S關(guān)卡。） 2）G1S轉(zhuǎn)折和S期調(diào)控：通過限制點(diǎn)的細(xì)胞做好DNA復(fù)制準(zhǔn)備就可通過G1S轉(zhuǎn)折，開始DNA復(fù)制，進(jìn)入S期。細(xì)胞受到生長因子刺激→在G1中期表達(dá)cyclin D，G1晚期期表達(dá)cyclin E分別與Cdk4/6 和Cdk2形成復(fù)合物→復(fù)合物使Rb蛋白磷酸化而釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F靶基因表達(dá)，不再依賴生長因子→通過限制點(diǎn)。 14 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） ：G1晚期的限制點(diǎn)、G1S轉(zhuǎn)折、G2M轉(zhuǎn)折、MG1有絲分裂關(guān)卡。 十六、細(xì)胞周期的調(diào)控 細(xì)胞周期的調(diào)控主要是多蛋白參與的，針對細(xì)胞周期四個(gè)主要關(guān)卡的調(diào)控過程。 1) 配體與受體的結(jié)合導(dǎo)致受體變?yōu)槎垠w結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致其發(fā)生自身磷酸化，并磷酸化IRS1(胰島素受體底物1)蛋白； 2）磷酸化的IRS1通過SH2與PI3K（磷脂酰肌醇3激酶）的p85亞基結(jié)合，激活p110催化亞基； 3）PI3K催化PIP2生成PIP3（磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸）； 4）PIP3與蛋白激酶PDK1共同激活PKB； 5）PKB磷酸化目標(biāo)底物，介導(dǎo)代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞存活等效應(yīng)。 4）活化的Ras進(jìn)而活化Raf，Raf是一種MAPKKK,可逐步激活MEK（MAPKK）→ERK1（MAPK），完成MAPK的級聯(lián)活化； 5）活化的ERK1轉(zhuǎn)位至核內(nèi)，作用于一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，影響基因的表達(dá)。配體結(jié)合在α亞基部位，β亞基具有內(nèi)在的酪氨酸蛋白激酶（PTK）活性。 當(dāng)生長激素抑制素等與相應(yīng)受體結(jié)合可結(jié)合偶聯(lián)αiG蛋白，αi亞基可直接抑制AC活性，同時(shí)游離的βγ亞基可與αs亞基結(jié)合抑制對AC的活化作用，使AC活性下降。 5）GTP與α亞基結(jié)合幾秒后被α亞基的GTP酶活性催化為GDP，α亞基與βγ亞基重新結(jié)合，關(guān)閉信號使AC失活。 3）在Mg2+存在下，GTP取代GDP使α亞基暴露與AC結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合并激活A(yù)C。信息傳遞過程為：細(xì)胞外信號物質(zhì)→受體→G蛋白→AC→PKA→酶或功能蛋白質(zhì)→生物學(xué)效應(yīng) 1）不存在受體激動(dòng)劑時(shí)，G蛋白的3個(gè)亞基呈聚合狀態(tài)，α亞基與GDP結(jié)合。 同時(shí)，α亞基水解GTP為GDP，然后α亞基GDP復(fù)合物重新與βγ亞基結(jié)合形成無活性的三聚體，完成一次信息傳導(dǎo)。 12 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 十二、G蛋白循環(huán) 受體與信號分子結(jié)合后，受體構(gòu)象改變，結(jié)合G蛋白并使其構(gòu)象改變，使GTP置換了GDP。主要與細(xì)胞增殖、分裂、分化及癌變有關(guān)。 膜受體主要是傳遞水溶性信號分子，又可分為：1）離子通道受體：此類受體主要結(jié)合神經(jīng)遞質(zhì)，使離子通道打開或關(guān)閉，改變膜的通透性，能迅速、準(zhǔn)確低傳遞神經(jīng)沖動(dòng)，但作用時(shí)間短；2）G蛋白偶聯(lián)受體：通過G蛋白影響AC或PLC等改變第二信使?jié)舛?，?shí)現(xiàn)跨膜信息傳遞。 ：高度特異性、高親和力、可飽和性、可逆性、放大效應(yīng)。 3. mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制調(diào)節(jié)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的mRNA量。 十、真核生物轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控機(jī)制 ’端加帽和3’端多聚腺苷酸化：是保持mRNA轉(zhuǎn)錄過程穩(wěn)定，不被降解的重要因素。 3）反式作用因子作用方式有多種模式：成環(huán)、扭曲、滑動(dòng)等。 ： 1）反式作用因子活性的調(diào)節(jié)：①表達(dá)調(diào)節(jié)－合成出來就有活性；②共價(jià)修飾－磷酸化、去磷酸化、糖基化；③配體結(jié)合－許多激素受體是反式作用因子；④蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用－復(fù)合物的解離與形成。 11 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 這個(gè)過程反式作用因子的作用是：促進(jìn)或抑制TFⅡD與TATA盒結(jié)合；促進(jìn)或抑制RNA聚合酶與TFⅡDDNA復(fù)合物的結(jié)合；促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成。 ：真核生物RNA聚合酶識別的是由通用轉(zhuǎn)錄因子與DNA形成的蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物，只有當(dāng)一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到DNA上，形成有功能的啟動(dòng)子，才能被RNA聚合酶所識別并結(jié)合。 ：該結(jié)構(gòu)含有高密度的堿性氨基酸，能與DNA結(jié)合，但無鋅指結(jié)構(gòu)、同源結(jié)構(gòu)和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。緊靠螺旋區(qū)N端有一段富含堿性氨基酸的序列可與DNA結(jié)合。 ：有些反式作用因子結(jié)合DNA結(jié)構(gòu)域中有一段約30個(gè)氨基酸組成的核心序列，每個(gè)6個(gè)氨基酸殘基有規(guī)律的出現(xiàn)1個(gè)亮氨酸殘基，能夠形成兩性α螺旋，一端為富含堿性氨基酸的親水的堿性區(qū)域，一端為成行亮氨酸構(gòu)成的疏水區(qū)（亮氨酸拉鏈區(qū)），兩個(gè)具有亮氨酸拉鏈區(qū)的單體以疏水力相互作用就形成了亮氨酸拉鏈，其堿性區(qū)域可以結(jié)合DNA。具有鋅指結(jié)構(gòu)的反式作用因子都含有幾個(gè)相同的鋅指結(jié)構(gòu)，每個(gè)指結(jié)構(gòu)的指尖部分可以進(jìn)入DNA雙螺旋的大溝或小溝。 八、反式作用因子結(jié)構(gòu)域，模體及其特點(diǎn) 反式作用因子一般具三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄活性域、結(jié)合其他蛋白的結(jié)合域。由于細(xì)菌轉(zhuǎn)錄翻譯偶聯(lián)，當(dāng)細(xì)胞中有色氨酸時(shí)可以形成色氨酰tRNA，核糖體可迅速通過相鄰兩個(gè)色氨酸位點(diǎn)，封閉片段2，致使片段4 10 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，終止轉(zhuǎn)錄。4形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)后緊跟著寡尿嘧啶，是不依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止信號。衰減子位于結(jié)構(gòu)基因E和操縱元件之間的L基因中。R是調(diào)節(jié)基因，編碼阻遏蛋白，在細(xì)胞內(nèi)有大量色氨酸存在時(shí)與操縱元件結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄，無色氨酸時(shí)則不結(jié)合，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。 七、色氨酸操縱子的作用機(jī)制 色氨酸操縱子（trp operon）是一種阻遏型操縱子，含E、D、C、B、A五個(gè)結(jié)構(gòu)基因，編碼色氨酸合成相關(guān)酶。 Lac啟動(dòng)子是弱啟動(dòng)子，與RNA聚合酶結(jié)合能力弱，需要CAP對其進(jìn)行正調(diào)控。 在乳糖存在時(shí)，乳糖經(jīng)透酶作用進(jìn)入細(xì)胞，在由β半乳糖苷酶催化生成半乳糖。啟動(dòng)子、操縱元件和CAP結(jié)合位點(diǎn)共同構(gòu)成了Lac操縱子的調(diào)控區(qū)。 六、乳糖操縱子的作用機(jī)制 乳糖操縱子（lac operon）含Z、Y、A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼β半乳糖苷酶、透酶、乙?；D(zhuǎn)移酶。 ：如果真核生物基因突變發(fā)生在hnRNA的剪接位點(diǎn)上，導(dǎo)致剪接位點(diǎn)消失或產(chǎn)生新的剪接位點(diǎn)都將導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物的異常，改變相應(yīng)的生物性狀。如果插入或缺失核苷酸是3的整數(shù)倍，合成多肽鏈就會增加或減少一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸。 3）同義突變：雖然基因結(jié)構(gòu)中有堿基取代，但由于遺傳密碼的簡并性，而不引起蛋白質(zhì)氨基酸組成和排列順序發(fā)生任何改變。 1）錯(cuò)義突變：因?yàn)镈NA分子中堿基的取代，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄翻譯后蛋白質(zhì)氨基酸組成和排列順序發(fā)生改變。 ：這是真核生物誘導(dǎo)修復(fù)的主要機(jī)制，通過該機(jī)制可以誘導(dǎo)修復(fù)基因轉(zhuǎn)錄，或暫時(shí)阻斷細(xì)胞周期，或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。包括同源重組和非同源重組。 1）單個(gè)堿基切除修復(fù)：特定DNA糖苷酶識別并切除受損堿基→AP核酸內(nèi)切酶在無堿基部位將DNA鏈的磷酸二酯鍵切開→外切核酸酶 8 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 切除脫氧核糖殘基→DNA聚合酶和連接酶修復(fù)缺口； 2）核苷酸片段切除修復(fù)：先由一個(gè)酶系統(tǒng)識別損傷部位，然后在損傷兩側(cè)各水解一個(gè)磷酸二酯鍵，釋放一段核苷酸，最后在DNA聚合酶和連接酶修復(fù)損傷區(qū)。 ：如吖啶類化合物的插入，生物氧化的自由基與DNA發(fā)生加成和小自由基反應(yīng)等。 1）導(dǎo)致堿基烷基化，影響堿基配對； 2）導(dǎo)致堿基脫落，造成子代DNA序列改變； 3）導(dǎo)致DNA鏈斷裂； 4）導(dǎo)致DNA交聯(lián)。 7 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 二、DNA損傷因素及機(jī)制 1）形成胸腺嘧啶二聚體，影響雙螺旋結(jié)構(gòu)，使復(fù)制和轉(zhuǎn)錄受阻； 2）引起DNA間交聯(lián)，DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)，甚至DNA鏈斷裂。 1）通常由環(huán)狀雙鏈DNA分子組成，只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)； 2）具有操縱子結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為多順反子； 3）絕大多數(shù)為單拷貝（編碼rRNA的基因有多個(gè)拷貝）； 4）編碼區(qū)所占比例較大（大于真核小于病毒），且重復(fù)序列很少； 5）含有編碼同工酶的同基因； 6）不同原核生物基因組GC含量變化大，可用于鑒別細(xì)菌種類； 7）細(xì)菌基因組中的可移動(dòng)成分能產(chǎn)生轉(zhuǎn)座現(xiàn)象； 8）細(xì)菌染色體外存在質(zhì)粒DNA。 6 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 問答題 一、病毒、原核、真核基因組的特點(diǎn) 1）病毒基因組較小，是單倍體； 2）形式多樣：病毒基因組有的是DNA，有的是RNA，但只含一種核酸。可分為DNA探針、cDNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針。粘?？梢韵袷删w一樣被包裝成λ粒子。這種載體能插入大片段DNA，一般認(rèn)為攜帶1Mb的插入片段，主要是用來構(gòu)建大片段 DNA 文庫。G蛋白具有結(jié)合GDP或GTP的能力，并有催化GTP成GDP的活性，廣泛存在各種組織細(xì)胞膜上，在受體和效應(yīng)蛋白間起傳遞信息的作用。與受體呈特異性結(jié)合的信號分子稱為配體。又稱為第一信使。 63. 三鏈DNA:一些DNA或RNA寡核苷酸片段能特異結(jié)合在的DNA的大溝中，并與富含嘌呤鏈上的堿基形成氫鍵，這樣的結(jié)構(gòu)稱為三鏈DNA。 61. PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）：PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正?；蚝妥儺惢虻挠捎跇?gòu)象的不同因而遷移位置不同，借此可分析確定致病基因的存在，常用于點(diǎn)突變的檢測。 59. 反義核酸技術(shù)：是通過合成一種與目標(biāo)DNA或RAN特異性互補(bǔ)的反義核酸片段，來干擾目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯等過程的技術(shù)。 58. 核酸分子雜交：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則退火形成雙鏈。 56. 基因打靶：通過DNA定點(diǎn)同源重組，改變基因組中某一特定基因，從而在生物體內(nèi)研究該基因功能?？梢宰鳛榛虮磉_(dá)和病毒復(fù)制的抑制劑。未受刺激細(xì)胞內(nèi)MAPK無活性，可因逐級磷酸化反應(yīng)而激活。對蛋白質(zhì)激酶所引起的變化產(chǎn)生衰減信號。 4 分子生物學(xué)考試寶典（私房版） 51. 蛋白激酶：能夠?qū)ⅵ昧姿峄鶊F(tuán)從磷酸供體分子上轉(zhuǎn)移至底物蛋白的氨基酸受體上的一大類酶。 49. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：是指基因組中整合有人工導(dǎo)入的外源基因、外源基因能夠表達(dá)并按孟德爾定律遺傳的一類動(dòng)物。具有鋅指結(jié)構(gòu)的反式作用因子都含有幾個(gè)相同的鋅指結(jié)構(gòu)。包括：啟動(dòng)子、上游啟動(dòng)元件、增強(qiáng)子、加尾信號和一些反應(yīng)元件等。（反式作用因子的三個(gè)基本特征：①一般具三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄活性域、結(jié)合其他蛋白的結(jié)合域；②能識別并結(jié)合順式作用元件；③對基因表達(dá)有正性和負(fù)性調(diào)控作用。端粒DNA由短的高度重復(fù)序列組成，重復(fù)序列在DNA復(fù)制過程中正常復(fù)制，部分由端粒酶延伸。 43. DNA復(fù)性：促使變性的因素解除后，兩條DNA鏈通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合形成DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。 42. DNA變性：在理化因素作用下DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。 40. 轉(zhuǎn)染（transfection）：真核