分子生物學(xué)第五章分子生物學(xué)研究法-文庫(kù)吧資料
2025-01-19 08:02本頁(yè)面
【正文】 特異性強(qiáng)： PCR反應(yīng)的特異性決定因素為： ① 引物與模板 DNA特異正確的結(jié)合； ② 堿基配對(duì)原則； ③ Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性； ④ 靶基因的特異性與保守性。 ? Mg2+濃度 Mg2+對(duì) PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響， PCR反應(yīng)中各 dNTP濃度為 200umol/L時(shí)， Mg2+濃度為 。 SDS主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白， SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶 K能水解蛋白質(zhì)，特別是組蛋白，再用有機(jī)酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。 dNTP能與Mg2 +結(jié)合 ， 使游離的 Mg2 +濃度降低 。 ? 在 PCR反應(yīng)中 ， dNTP應(yīng)為 50200umol/L，尤其是注意 4種 dNTP的濃度要相等 (等摩爾配制 )， 如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí) (偏高或偏低 )， 就會(huì)引起 錯(cuò)配 。 dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以 1M NaOH或 1M Tris－ HCl的緩沖液將其 pH調(diào)節(jié)到 ～ ，小量分裝， 20℃ 冰凍保存。 ? 酶及其濃度 目前有２種 Taq DNA聚合酶， 催化一典型的 PCR反應(yīng)約需酶量 (指總反應(yīng)體積為 100uＬ時(shí) )，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。 ⑥ 引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴(kuò)增的 靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對(duì)酶切分析 或分子克隆很有好處。 ④ 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間 互補(bǔ)，特別是 3‘端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二 聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。 ③引物堿基： G+C含量以 4060%為宜， G+C太少擴(kuò)增 效果不佳， G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。 設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則： ①引物長(zhǎng)度 : 1530bp，常用為 20bp左右。 PCR 循環(huán)次數(shù)主要取決于模板 DNA的濃度。理論上，只要知道任何一段模 板 DNA序列， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸 鏈做引物，利用 PCR就可將模板 DNA在體外 大量擴(kuò)增。 每完成一個(gè)循環(huán)需 2～ 4分鐘， 2～ 3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。 （ 2） PCR技術(shù)的基本原理 ? 假定我們要研究的 DNA雙鏈兩端的序列是 ： TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA ? PCR前先人工合成兩段有 2030堿基的引物，能夠分別與上下兩條鏈的一端配對(duì)，把這兩段引物和 DNA模板、 DNA聚合酶、底物（四種脫氧核苷）混合在一起，我們就可以開始做 PCR了。具有較高的特異性、靈敏性和效率，此酶的發(fā)現(xiàn)使 PCR廣泛的被應(yīng)用。③大大提高擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加擴(kuò)增長(zhǎng)度 ()。 ? 具有以下特點(diǎn)：① 耐高溫 。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。②引物鏈延伸反應(yīng)在 37℃ 下進(jìn)行易發(fā)生堿基錯(cuò)配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的 DNA片段不均一。其原理類似于 DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給 DNA的體外合成提供以致一種合適的條件 摸板 DNA ，寡核苷酸引物， DNA聚合酶，合適的緩沖體系， DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間。 (1)PCR技術(shù)簡(jiǎn)史 PCR的最早設(shè)想 ? 核酸研究已有 100多年的歷史，本世紀(jì) 60年代末、 70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)， Korana于 1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想： “ 經(jīng)過 DNA變性，與合適的引物雜交，用 DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆 tRNA基因 ” 。在短短的幾年內(nèi)， PCR迅速成為分子生物學(xué)的一項(xiàng)常規(guī)手段，并得到了廣泛的實(shí)際應(yīng)用，被許多科學(xué)家視為近十年分子生物學(xué)領(lǐng)域最重要的一項(xiàng)技術(shù)突破。大家很快地紛紛采用這個(gè)方法，很多人還很奇怪自己怎么沒有首先想到這么做。 1983年，在一家生物高技術(shù)公司（ Cetus）工作的 Mullis著手解決用簡(jiǎn)單的方法鑒定某一段DNA的技術(shù)問題，有一天晚上他驅(qū)車在北部加州 101號(hào)高速公路上，靈機(jī)一動(dòng)想到了一個(gè)實(shí)際上可以無(wú)限擴(kuò)增某段 DNA的簡(jiǎn)單方法，即 PCR。 PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。反應(yīng)物加完后，溫度由 PCR儀調(diào)整，程序完成后可以拿到產(chǎn)物。 ? 待擴(kuò)增 DNA樣品 → 94℃ 1min → 變性 (解鏈 )→ 56℃ 1min → 退火 (引物結(jié)合靶 DNA區(qū)段 ) → 72℃ 1 至數(shù)分鐘 → 延伸，合成新生 DNA互補(bǔ)鏈。 PCR反應(yīng)的全過程 ? ＰＣＲ反應(yīng)包括 DNA解鏈 (變性 )、引物與模板 DNA相結(jié)合 (退火 )、 DNA合成 (延伸 )三步，被不斷重復(fù)。 PCR技術(shù)的原理 ? 先將雙鏈 DNA分子加熱分離成單鏈
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