【正文】 HL60、HT1080等細胞； ㈡瞬時表達的細胞：COS細胞和HEK 293細胞； ㈢哺乳動物細胞的選擇：細胞選擇的依據(jù)主要決定于基因表達的目的。：1）質(zhì)粒載體；2）桿狀病毒載體系統(tǒng)。但只有二者共轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，才能得到重組的桿狀病毒和在細胞中表達外源蛋白質(zhì)。大多含polyhedrin基因啟動子和外源插入位點，在啟動子上游（5 ’旁側(cè)）及外源插入基因下游（3’旁側(cè)）均有病毒基因序列。B：采用線性化的、必需病毒序列缺陷的野生型桿狀病毒（此病毒DNA不具備感染能力）共轉(zhuǎn)染。：1）啟動子：Ⅱ類啟動子常由TATA盒和部分上游啟動子元件組成；是TF ⅡD識別部位。重要包括：CAAT盒和GC盒。特點：能遠距離增強啟制動子的活性； 無方向性，在啟動子的上游和下游均起作用； 對啟動子的影響無嚴格的專一性。4）反應(yīng)元件：某些反式作用因子與特定刺激信號結(jié)合后，能與某些上游啟動子元件和增強子所結(jié)合，調(diào)節(jié)基因表達，這類順式作用元件即特稱中反應(yīng)元件5）沉默子：能抑制啟動子活性的DNA序列。4）其調(diào)節(jié)機涉及順式作用元件、RNA聚合酶和其它調(diào)節(jié)蛋白。：一個真核生物基因的轉(zhuǎn)錄需要3至5個轉(zhuǎn)錄因子。按不同組合，估計需轉(zhuǎn)錄因子３００余個即可。1）反式作用因子的活性調(diào)節(jié)：表達式調(diào)節(jié): 需要時才合成, 隨即被降解。2）反式作用因子與順式作用元件的結(jié)合：多數(shù)：先激活后結(jié)合。3）增強子與調(diào)基因可以很遠，上游啟動子亦相隔數(shù)十個堿基。：1）5′帽子結(jié)構(gòu)的作用：防止mRNA被5′→ 3′核酸酶降解；能被帽結(jié)合蛋白識別，增強mRNA的可翻譯性，沒帽子結(jié)構(gòu)，翻譯效率降低；促進mRNA從核到胞漿的運輸過程；增強mRNA的剪接效率, 帽對exon1的剪接尤為重要，需要2個帽結(jié)合蛋白參與（CBP80和CBP20）。： 選擇剪接方式：1）外顯子選擇：也稱外顯跳躍，選擇不同的外顯子進行剪接，成熟mRNA中外顯子數(shù)目不同；2）內(nèi)含子選擇：在不同的成熟mRNA中，內(nèi)含子可全無或保留某一個；3）相斥外顯子：二個外顯在不同成熟mRNA中只能出現(xiàn)其一，而不能共存；4）內(nèi)部剪接點：剪接點異常，導(dǎo)致成熟mRNA出現(xiàn)的只是某個外顯子或內(nèi)含子的一部分。(2)SD序列，且SD序列與AUG之間有合適距離（轉(zhuǎn)譯效率嚴格依賴于此）。(4)外源基因下游應(yīng)加入不依賴于ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū):(1).原核細胞的RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子，故需使用原核啟動子。(3).原核細胞缺乏RNA轉(zhuǎn)錄后加工的能力，所以真核目的基因為mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA。(5).外源基因在原核細胞的高效表達產(chǎn)物多為包含體。(2). 附加物的選取: 附加物有表位標(biāo)簽{如(His)GST、GFP等等。(4). 表達細胞(宿主)的選擇: 依據(jù)promoter與 host的相容性來選擇。 ：大腸桿菌（）；芽孢桿菌（Bacillus）；鏈霉菌（streptomyces）。 缺點：缺少真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后修飾和加工系統(tǒng)。宿主本身雜蛋白多，不利于提取。：1）穩(wěn)定的遺傳和復(fù)制能力。3）啟動子具有可調(diào)控性，本底轉(zhuǎn)錄水平低。5）具備外源基因插入的酶切位點。6）SD序列，且SD序列與ATG之間有合適距離。：1）非融合表達載體：細胞因子的表達； 2）融合表達載體：分子量較小蛋白質(zhì)表達；3）帶純化標(biāo)簽表達載體：便于目的蛋白純化的標(biāo)簽；4）分泌型表達載體；5）表面展示表達載體；6）帶分子伴侶的表達載體。2）增加mRNA的穩(wěn)定性。B）.利用某些蛋白水解酶基因的缺陷株為宿主菌。D）.采用融合表達或串聯(lián)表達。4）工程化宿主菌的選擇九、差異表達基因 ：篩選與疾病發(fā)生相關(guān)的功能基因：可深入研究基因組所有基因的功能研究意義：從基因水平揭示疾病的發(fā)生機制，探索治療疾病的有效方法。：尋找差異表達的基因。：雜交和洗滌條件難把握，會導(dǎo)致一定的假陽性率或假陰性率，分析圖象和數(shù)據(jù)耗時。：需要大量測序；過程復(fù)雜；步驟多；可能丟失短的基因片段；提供信息有限； (3).差異顯示PCR法：；：快速、所需RNA量少；：假陽性率高；對高拷貝基因有偏向性；所獲得的片段太短。(subtractive hybridization,SH )： 將實驗組mRNA(或cDNA)與對照組cDNA(或mRNA）雜交，去除雜交體和未雜交上的對照組成分（cDNA或mRNA），得到的為實驗組獨有的mRNA或cDNA，這些基因即是差異表達基因。 代表性差異分析技術(shù)的缺點：低豐度的身雜交的幾率很低；酶切連接步驟多，損失大；得不到全長cDNA。 2）基本原理：第一步 用限制性內(nèi)切酶（Rsa I或Hea III）對雙鏈cDNA消化；第二步把Tester cDNA均分為兩份,分別連接接頭；第三步兩輪消減雜交；第四步加入引物作2次PCR擴增。十、基因診斷、基因治療：1） 特異性強； 2）靈敏度高； 3）早期診斷； 4）檢測樣品局限性??；5） 應(yīng)用范圍廣。2）雜交方式：固液相雜交。3） 檢測手段: 非常規(guī)的顯色或放射自顯影。(ISPCR )技術(shù)：1）,在不破壞細胞的前提下,利用一些特定的檢測手段(例如，分子雜交)來檢測細胞內(nèi)的擴增產(chǎn)物。2）用途: ISPCR把PCR+原位雜交（ISH）技術(shù)這兩者結(jié)合起來,成為細胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測技術(shù)。在檢測細胞的潛在感染方面也具有重要意義。(single strand formation polymorphism, SSCP)：1）分析原理：單個或多個堿基不同、但序列長度相等的雙鏈核酸分子，經(jīng)變性成單鏈后可具有不同的構(gòu)象，在中性PAGE中的電泳遷移率不同，與正常的電泳圖型對照，新生條帶出現(xiàn)即可判定存在堿基變異。3）優(yōu)點：方法簡便,靈敏度較高。一般只限于檢測300bp以下的片段。：PCRASOH探針雜交法： 根據(jù)突變位點的上下游序列，設(shè)計合成寡核苷酸引物。1）作ASOH時，針對每種突變位點，分別合成2個寡核苷酸探針；其中一個能與正常序列完全互補，另一個則與具有突變的堿基序列完全互補；2）預(yù)雜交、雜交、洗膜、放射自顯影或顯色；使只有與探針序列完全互補的等位基因片段才顯示雜交信號，有錯配的探針則被洗脫，不顯示雜交信號；3）分析正常探針及突變探針分別雜交得到的顯影或顯色圖譜，即可作出基因診斷。：1）PCRRFLP分析；2）PCR限制酶酶譜分析；3）ASPCR；4）PCRSSCP；5）DNA測序等。2）基因較大且多位點(位點間距離較遠)存在插入或缺失，宜采用多重PCR法檢測。是由于α 珠蛋白基因的缺失或缺陷使α 鏈的合成受到抑制而引起的溶血性貧血。不能形成胎兒HbF，但形成γ 4，稱為Hb Bart ( γ 4) 。（B）.血紅蛋白H病：基因型 : a / 或 a / 亦可為 a aT/ ，稱為a0地貧和a+地貧的雙重雜合子。（C）輕型(標(biāo)準(zhǔn)型) a 地中海貧血：基因型：a a/ (a0地貧雜合子)或 a / a (a+地貧純合子)。輕型a地貧患者之間婚配，生育子女中患 Hb Bart’s胎兒水腫綜合征的機率為1/4。靜止型 a 地貧與輕型 a 地貧個體婚配，可有1/4機會生育Hb H病患兒。 2）PCR方法：設(shè)計3條引物進行雙重PCR擴增，A）若擴增出AB的314bp片段，而不能擴增出AC片段，則為正常；B）若擴增出AB的314bp片段,且能擴增出一條500600bp的片段(縮短了的AC),則為a地1；C）若只能擴增一條500600bp的片段，但不能擴增出AB的314bp片段,則為Bart’s水腫胎。受體細胞的培養(yǎng)224。目的基因?qū)氚屑毎?24?；蛑委煹陌踩员O(jiān)測和療效評價.(方法)的選擇：1）直接法(體內(nèi)法) ( in vivo )：特點：直接向體內(nèi)某組織(器官)轉(zhuǎn)基因。 2） 間接法(回輸法) ( ex vivo )或稱離體法。優(yōu)點：成功率相對較高；缺點：操作繁瑣。3）原位法 ( in situ )直接向患者的病變部位轉(zhuǎn)基因。2）病毒學(xué)方法： 是指以重組病毒為載體，通過感染將目的基因?qū)氚屑毎姆椒?。具有二倍體基因，RV可將其基因組整合到感染細胞的DNA上。 能有效轉(zhuǎn)錄的真核DNA序列連鎖時, 就能獲得有效表達, 從而產(chǎn)生新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶使G418失活。：1）基因置換(基因矯正)：有兩種含義:其一,指將致病基因整個地以正?；蛑脫Q，使致病基因永久性得到更正；其二，指對缺陷基因的異常序列進行精確的原位修復(fù)但不影響鄰近的基因。2）基因添加：在不去除異?；虻那疤嵯?， 將目的基因?qū)氩∽兗毎蚱渌毎?非定點整合)，以目的基因的表達產(chǎn)物來補償缺陷基因的功能或使原來的功能得到加強。 基因干預(yù)的靶基因：過度表達的癌基因、病毒復(fù)制周期的關(guān)鍵基因。(ribozyme)技術(shù)：核酶催化部份和底物部份組成錘頭結(jié)構(gòu)。2）同一分子上包括有催化部份和底物部份。(ADA)缺陷病的基因治療：1），基因全長32kb， mRNA長1 530bp。重組分子224。ADA gene表達224。 1~2月治療一次, %。2）腫瘤細胞的基因“修飾”。十一、生物芯片 ：1）易尋址，利用組合化學(xué)的原理安排各寡核苷酸的位點，芯片反應(yīng)后易尋址；2）點位牢固，用表面化學(xué)方法處理基片，使核苷酸固定在基片上；3）定點合成，光導(dǎo)向平板印刷技術(shù)，芯片表面可用屏蔽物屏蔽，光照選擇性脫保護，有利于定點合成寡核苷酸中的各個堿基；目前技術(shù)可達的集成度：10萬40萬點陣/cm2，探針長度8nt20nt。：(1).制作方式：(前者為別處合成和收集探針，后固化；后者是原位化學(xué)合成；(2).探針類型：(前者可用常規(guī)分子生物學(xué)方法合成的任一種探針,后者為化學(xué)合成寡核苷酸)；(3).探針長度：(前者為后者的十倍到幾十倍)；(4).探針集成度：(前者低，后者高)；(5).技術(shù)保密性(只有后者受專利保護)。(2)待測樣品核酸的提取、擴增與標(biāo)記：探針不標(biāo)記，而待測核酸(液相)標(biāo)記。(4)掃描與圖像分析，數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理與分析。用激光點光源照射聚合部位,以去除光敏保護基(X),露活性羥基(OH)224。更換另一掩模(M2)，激光點光源照射下一個位點224。重復(fù)上述步驟，直至合成完所需探針. (二)壓電打印法. (三)分子印章法: 寡核苷酸合成試劑224。 壓印獲得芯片(特定位點)224。2）芯片雜交的特點：探針的數(shù)量靶基因的數(shù)量。4）雜交信號強度∝ (樣品)靶基因的量。 靶分子；探針224。6）雜交反應(yīng)條件與反應(yīng)條件的優(yōu)化。：注意事項：1）不同來源的樣品分別用不同顏色的熒光素標(biāo)記(Cy3為紅色,標(biāo)記處理組；Cy5為綠色,標(biāo)記對照組)，以便比較分析；） 2）對同一種dNTP，既要加入熒光標(biāo)記的，也要加入非標(biāo)記的(如Cy3dCTP與dCTP)，并調(diào)整兩者的比例，使雜交信號最強。 后續(xù)步驟： 終止反應(yīng)224。過柱(濾去游離的熒光核苷酸)224。溶解樣品。：1）疾病診斷所依據(jù)的標(biāo)志性蛋白質(zhì)分子；2）對藥物的療效、毒副作用作出評價；3）尋找藥物作用的靶蛋白。：特定的細胞釋放信息物質(zhì)224。與靶細胞的受體特異性結(jié)合224。靶細胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。：1）由兩個相同亞基組成；2）被cGMP激活；信號通路：3）ANP,NO,細菌內(nèi)毒素等→作用于具有GC活性的受體→GC激活→cGMP↑→PKG活性↑→蛋白磷酸化→生理效應(yīng)：1）與病毒癌基因 vakt編碼的蛋白Akt同源，又稱為Akt；2）為單鏈結(jié)構(gòu)，有三種亞型；3）可與PIP3結(jié)合而間接被激活；4）與細胞代謝、凋亡、癌變有關(guān)。 （MAPK）：1）MAPK是蛋白激酶家族,包括ERK,JNK和p38MAPK三個亞家族；2）激活級聯(lián)反應(yīng)：MAPKKK(Raf) →MAPKK(MEK) →MAPK(ERK) →生理作用。（PTK or TPK）：1）此類激酶促進蛋白質(zhì)中酪氨酸的磷酸化。3）PTK與細胞生長、增殖、癌變有關(guān)。：1）G蛋白是多種膜受體傳入信號的“開關(guān)”。巳知17種α亞基,5種β亞基,7種γ亞基,故G蛋白是一個大家族。：1）分子量2萬3萬的單鏈結(jié)構(gòu)，功能類似異三聚體G protein的α亞基，可結(jié)合GTP或GDP,并有GTP酶活性；2）最重要的是癌基因Ras和 Rho亞家族；3）RasGTP代表“開”,RasGDP代表“關(guān)”.控制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。2）其作用與蛋白激酶相反，）抑癌基因產(chǎn)物PTEN是一種磷酸酶，可使PIP3脫磷酸化為PIP2，也可催化蛋白質(zhì)中磷酸酪氨酸或絲/蘇氨酸脫磷酸(PLC) ：PIP2＋H2O－→IP3＋ DAG(PIK) ：不同的kinase 利用ATP催化PI逐級磷酸化 PI→PI4P→PI(4,5)P2 → PI(3,4,5)P3。 PI4P———PI（4）P2。3）PI（5）P3似與細胞生長、分裂、癌變、運動有關(guān)(NOS) ：L精氨酸＋2NADPH＋2O2→L瓜氨酸＋NO+2H2O：1）膜受體：存在于細胞質(zhì)膜上的受體，絕大部分是鑲嵌糖蛋白。2）胞內(nèi)受體：位于細胞漿和細胞核中的受體，全部為DNA結(jié)合蛋白。：1）高度專一性；2）高度親和力；3）可飽和性；4）可逆性；5）特定的作用模式。 蛋白激酶Ａ途徑：1）組成: 胞外信息分子，受體，G蛋白，腺苷酸環(huán)化酶AC)， cAMP，蛋白激酶 A(PKA)。受體224。酶224。蛋白激酶224。生物學(xué)效應(yīng). 3）生理意義：通過對效應(yīng)蛋白的磷酸化作用，實現(xiàn)其調(diào)節(jié)功能，如促進蛋白質(zhì)合成、改變膜對水及離子通道的通透性、影響細胞分泌、加強心肌收縮。 2）Ca2+－ CaM激酶途徑組成:受體、G蛋白、PLC、IPCa2+、鈣調(diào)蛋白、CaM激酶。② 調(diào)節(jié)基因表達。：1）組成:受體，鳥苷酸環(huán)化酶(GC)，cGMP, 蛋白激酶G (PKG)。利尿和舒張血管的作用。2）JAKsSTAT途徑(多種細胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路)組成:非催化性受體，JAKs (janus kinases)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激動子 (STAT)。：1) TNF――――― Cer 等激酶系統(tǒng)――――――激活NF kB病毒感染、脂多糖、活性氧中間體、佛波酯、雙鏈RNA等 2)生理意義：主要涉及機體防御反應(yīng)、組織損傷和應(yīng)激、細胞分化和凋亡，以及腫瘤生長抑制過程的