【正文】 ：1）組成:受體，鳥苷酸環(huán)化酶(GC)，cGMP, 蛋白激酶G (PKG)。：1）高度專一性；2）高度親和力；3）可飽和性；4）可逆性；5）特定的作用模式。3）PTK與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、癌變有關(guān)。溶解樣品。 壓印獲得芯片(特定位點(diǎn))224。2）腫瘤細(xì)胞的基因“修飾”。2）基因添加：在不去除異?；虻那疤嵯?， 將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其他細(xì)胞(非定點(diǎn)整合)，以目的基因的表達(dá)產(chǎn)物來補(bǔ)償缺陷基因的功能或使原來的功能得到加強(qiáng)?；蛑委煹陌踩员O(jiān)測(cè)和療效評(píng)價(jià).(方法)的選擇：1）直接法(體內(nèi)法) ( in vivo )：特點(diǎn)：直接向體內(nèi)某組織(器官)轉(zhuǎn)基因。不能形成胎兒HbF，但形成γ 4，稱為Hb Bart ( γ 4) 。(single strand formation polymorphism, SSCP)：1）分析原理：?jiǎn)蝹€(gè)或多個(gè)堿基不同、但序列長(zhǎng)度相等的雙鏈核酸分子，經(jīng)變性成單鏈后可具有不同的構(gòu)象，在中性PAGE中的電泳遷移率不同，與正常的電泳圖型對(duì)照，新生條帶出現(xiàn)即可判定存在堿基變異。 代表性差異分析技術(shù)的缺點(diǎn)：低豐度的身雜交的幾率很低；酶切連接步驟多，損失大；得不到全長(zhǎng)cDNA。2）增加mRNA的穩(wěn)定性。 ：大腸桿菌（）；芽孢桿菌（Bacillus）；鏈霉菌（streptomyces）。：1）5′帽子結(jié)構(gòu)的作用：防止mRNA被5′→ 3′核酸酶降解；能被帽結(jié)合蛋白識(shí)別，增強(qiáng)mRNA的可翻譯性，沒帽子結(jié)構(gòu)，翻譯效率降低；促進(jìn)mRNA從核到胞漿的運(yùn)輸過程；增強(qiáng)mRNA的剪接效率, 帽對(duì)exon1的剪接尤為重要，需要2個(gè)帽結(jié)合蛋白參與（CBP80和CBP20）。特點(diǎn)：能遠(yuǎn)距離增強(qiáng)啟制動(dòng)子的活性； 無方向性，在啟動(dòng)子的上游和下游均起作用； 對(duì)啟動(dòng)子的影響無嚴(yán)格的專一性。3）. 篩選標(biāo)記的選擇；4）. 宿主選擇: 依據(jù)啟動(dòng)子與宿主的相容性來選擇。決定產(chǎn)物的特異性；6）引物的5 39。七、DNA的P C R：類似于DNA的天然復(fù)制過程，是以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分別與模板5`末端和3`末端相互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸，直至完成新的DNA合成，反復(fù)重復(fù)這一過程，即可使目的DNA片段得到擴(kuò)增。 缺點(diǎn)：1）半衰期短, 隨用隨標(biāo)；2）放射性污染。 程序： 限制性內(nèi)切酶消化DNA→瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段→轉(zhuǎn)印到NC膜或尼龍膜→堿變性、中和→預(yù)雜交、雜交→放射性自顯影. 其基本原理毛細(xì)管轉(zhuǎn)移: 將RNA樣品變性和通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，再轉(zhuǎn)移到NC膜等固相載體上，用標(biāo)記的DNA或RNA特異探針對(duì)固定在膜上的RNA進(jìn)行雜交。 用途：1）主要作用是在載體或目的基因 3′末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于DNA重組。：（一）按功能分類：1）克隆型載體； 2）表達(dá)型載體。②分離編碼結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短DNA結(jié)合位點(diǎn)蛋白的新基因。(2)某些蛋白在酵母中不穩(wěn)定表達(dá)或不能準(zhǔn)確定位到胞核內(nèi)。 原因：①BD融合誘餌蛋白的單獨(dú)激活作用。原因：①采用高拷貝和強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體，使融合蛋白過量表達(dá)；②激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，之后又與啟動(dòng)子結(jié)合，此三元復(fù)合體使融合蛋白各組分間結(jié)合更趨于穩(wěn)定；③通過mRNA使信號(hào)放大； ④檢測(cè)的結(jié)果是基因表達(dá)產(chǎn)物的累積效應(yīng)，可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)間的微弱或暫時(shí)的相互作用。9）拖尾：樣品溶解不充分；膠板不干凈。 4）親和層析。 (3)電位梯度的不連續(xù)性：在不連續(xù)系統(tǒng)中，電位梯度的差異是自動(dòng)形成的。(5). 獲取產(chǎn)物蛋白。 2）Bradford檢測(cè)法：考馬斯亮藍(lán)G250在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色溶液，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，反應(yīng)迅速而穩(wěn)。如果損傷不能修復(fù)， P53就激活那些誘導(dǎo)凋亡的基因表達(dá)，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)。(2)當(dāng)Bax/Bax同源二聚體形成時(shí)，便誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；(3).隨bcl2表達(dá)量增加，漸多的Bax/Bax解聚，形成更穩(wěn)定的Bax/Bcl2異源二聚體，從而中和了‘Bax/Bax’誘導(dǎo)凋亡的作用。:(1)死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。3）轉(zhuǎn)錄圖又稱表達(dá)序列圖或cDNA圖的路標(biāo):是以部分5 ’端或3’端cDNA序列（即表達(dá)序列標(biāo)簽，EST）為路標(biāo)，根據(jù)表達(dá)順序的位置和距離作圖4）序列圖：測(cè)定總長(zhǎng)約30億個(gè)核苷酸組成的全染色體序列。（三） 基因組存在高比例的非編碼序列 (non coding sequence, NCS), NCS可作進(jìn)化標(biāo)尺。（四） 大量重復(fù)序列（repeat sequence）存在。：、釀酒酵母、黑腹果蠅、秀麗線蟲和小鼠，其序列分析被列為HGP的內(nèi)容；：DNA多態(tài)性:除同卵雙生的兩個(gè)體外，沒有兩個(gè)人的DNA組成是完全相同的，即人類DNA組成具有多態(tài)性。(2)線粒體相關(guān)蛋白的凋亡誘導(dǎo)途徑：線粒體跨膜電位(Δψm)的下降，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔（MPT）破壞或開放，開放的后果是， Δψm 下降、氧化磷化脫偶聯(lián)、GSH耗竭、ROS產(chǎn)生等，并形成惡習(xí)性循環(huán)。即Bax和Bcl2 比值調(diào)節(jié)凋亡；(4) 當(dāng)Bclxs存在時(shí)，優(yōu)先形成Bclxs/Bcl2 ，使Bax/Bax形式保留，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。3）Bcl2屬凋亡抑制基因，阻遏細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命。藍(lán)色復(fù)合物在595 mn波長(zhǎng)處具有最大光吸收值，并與溶液中蛋白質(zhì)濃度成正比，因此可檢測(cè)595 mn的光吸收值大小計(jì)算蛋白的含量。3. 包涵體的成份：包涵體是表達(dá)蛋白非天然形式的混合物，包括目的蛋白、宿主細(xì)胞蛋白及膜蛋白片段，DNA、RNA和質(zhì)粒編碼蛋白以及LPS。(4)pH的不連續(xù)性：濃縮膠pH：： 分離膠pH：； 緩沖液pH：。：1）假設(shè)有兩種互不混溶的溶劑S和M，將A物質(zhì)溶于一定量的S溶劑中，再加入一定量的M溶劑；2）A物質(zhì)在兩相中相互擴(kuò)散；3）A物質(zhì)在兩相中達(dá)到了平衡(在同一時(shí)間內(nèi)，進(jìn)出兩相的A物質(zhì)的分子數(shù)完全相等)時(shí)，其分配系數(shù)為常數(shù)K=CAS/ CAM。20. 蛋白質(zhì)的濃縮：1）超濾法；2）冷凍干燥法；3）吸收法：聚乙二醇 (PEG)、蔗糖、凝膠等； 4）沉淀法。(2)真實(shí)性。這種融合蛋白的激活作用被外來蛋白激活。在細(xì)胞表面發(fā)生的相互作用可采用噬菌體顯示系統(tǒng)。③定位已經(jīng)證實(shí)的具有相互作用的DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及準(zhǔn)確定位與DNA結(jié)合的核苷酸序列。 （二）按受體細(xì)胞分類：1）原核細(xì)胞載體：原核克隆型載體，原核表達(dá)型載體； 2）真核細(xì)胞載體（穿梭載體）：真核表達(dá)型載體，真核轉(zhuǎn)遞型載體。 2）DNA 3′末端的同位素標(biāo)記。：相同點(diǎn)：基本原理。非放射性標(biāo)記物：優(yōu)點(diǎn)：1）無放射性污染；2）穩(wěn)定性好,可較長(zhǎng)時(shí)間存放。PCR反應(yīng)的特異性依賴于2個(gè)與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物，取決于2個(gè)引物設(shè)計(jì)的好壞，依賴于引物與模板結(jié)合的正確性，退火溫度。端限定PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度, 5 39。5 ）.外源基因的大小: 注意載體對(duì)外源基因的容量要求。 作用機(jī)制：可能通過與某些調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)而發(fā)揮作用。 2）Poly(A)尾的作用：延長(zhǎng)mRNA的半衰期限； 促進(jìn)翻譯效率。：1）優(yōu)點(diǎn)：遺傳背景清楚、目的基因表達(dá)水平高、培養(yǎng)周期短。3）提高外源蛋白的穩(wěn)定性：A）.利用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)把目的蛋白積累在間周質(zhì)或分泌到胞外。（SSH）：1）具體過程：第一階段：與RDA法類似，用識(shí)別4堿基的限制酶(如Hae Ⅲ 等)消化實(shí)驗(yàn)組(Tester)與驅(qū)動(dòng)組(Driver)cDNA ,得到平末端cDNA短片段；第二階段： 實(shí)驗(yàn)組cDNA均分為兩份,分別加接頭1和接頭2，各自與過量的驅(qū)動(dòng)組cDNA酶切片段雜交，雜交產(chǎn)物混合后再與驅(qū)動(dòng)組新的cDNA酶切片段進(jìn)行第二輪雜交，產(chǎn)物補(bǔ)平后作為模板，加引物作2次PCR擴(kuò)增。2）應(yīng)用：廣泛用于大批樣品基因突變的檢測(cè)(初篩)。Hb Bart對(duì)氧的親和力極高，造成組織嚴(yán)重缺氧, 導(dǎo)致胎兒水腫, 引起死胎或新生兒死亡。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便；缺點(diǎn)：基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的效率都較低。3）基因干預(yù) 是指采用特定的手段，抑制或阻斷某個(gè)基因的表達(dá)。3）調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。 合成反應(yīng). :1）芯片的雜交類型：固液相雜交(固相：探針；液相：靶分子核酸)。：1） 溫度；2）探針堿基組成及其濃度；3）靶核酸長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度；4）雜交液的組成。4）PTK抑制劑中可篩選抗癌藥。：1）磷酸化與脫磷酸化作用；2）膜磷脂的代謝的影響；3）酶促水解作用；4）Ｇ蛋白的調(diào)節(jié)。2）生理效應(yīng)：PKG使有關(guān)蛋白或酶類的絲、蘇氨酸殘基磷酸化，如心鈉素、NO舒張血管平滑肌。對(duì)膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能、機(jī)體代謝、基因表達(dá)、細(xì)胞分化和增殖等的調(diào)節(jié)起作用。受體的結(jié)構(gòu)：高度可變區(qū)，DNA結(jié)合區(qū)，激素結(jié)合區(qū)，鉸鏈區(qū)。2）分為兩大類:受體型PTK—許多生長(zhǎng)因子受體；非受體型PTK,如src,abl,FAK。洗脫、濃縮 、真空干燥224。分子印章(涂布)224。:1）抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞：；；；?；蚨c(diǎn)突變、定點(diǎn)敲除和定點(diǎn)修復(fù)均屬于基因打靶(gene targeting)技術(shù)。轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的篩選和鑒定224。 2）α 地貧的基因型： α / αα (稱α+ 地貧)； / αα (稱αo 地貧). 3）α地貧的臨床類型： （A）.Hb Bart’s 胎兒水腫綜合征：基因型 / ，稱為α0 地貧純合子。3）操作步驟：；；。：使用PCR以指數(shù)形式擴(kuò)增雙分子自鏈模板，以線性形式擴(kuò)增單鏈模板的特性，通過消減和富集，使得目的基因片段得到特異性擴(kuò)增。：1）表達(dá)載體的優(yōu)化設(shè)計(jì)與選擇：A）選擇適當(dāng)?shù)膹?qiáng)啟動(dòng)子；B）引入原核增強(qiáng)子樣序列；C）.設(shè)計(jì)合理的SD序列；D）.外源基因中稀有密碼子的影響，解決辦法：堿基突變和共表達(dá)稀有密碼子的tRNA基因。(5) .外源基因的大小(bp數(shù)): 注意某些病毒載體對(duì)外源基因的容量。反式作用因子的作用模式：扭曲、滑動(dòng)、成環(huán)等4）中介因子對(duì)轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控5）多重增強(qiáng)子作用：金屬硫蛋白基因；組合式基因調(diào)控。3）增強(qiáng)子：能增強(qiáng)啟動(dòng)子活性的DNA序列。2）. 附加物的選取: 附加物有表位標(biāo)簽{如(His)GST}、GFP等。端不能有任何修飾, 3 39。：1）毛細(xì)管轉(zhuǎn)移；2）電轉(zhuǎn)移法；3）真空轉(zhuǎn)移法。：優(yōu)點(diǎn)：1）靈敏度極高；2）放射性核素對(duì)各種酶促反應(yīng)無任何影響,也不會(huì)影響堿基配對(duì)的特異性與穩(wěn)定性和雜交性質(zhì)；3）極高的特異性。、轉(zhuǎn)染程序：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌――― 感受態(tài)細(xì)菌(4℃保存24h) 37℃，倒置培養(yǎng)重組質(zhì)粒DNA+細(xì)菌熱休克蛋（42度，90秒）普通培養(yǎng)基溫育涂布于含抗生素的培養(yǎng)基平板單菌落20. Southern印跡雜交是將經(jīng)凝膠分離的DNA轉(zhuǎn)移到合適的固相支持物，再通過特異性探針的雜交來檢測(cè)被轉(zhuǎn)移的DNA片段的一種技術(shù)。(TdT)：功能：催化多個(gè)脫氧核苷酸依次加到單鏈或雙鏈DNA分子的3′OH末端。(4)表達(dá)型載體還應(yīng)有強(qiáng)啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子等調(diào)控元件。①確定已知DNA蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。雙雜交前刪除該部分，但應(yīng)避免刪除相互作用的結(jié)構(gòu)域。1）假陽性定義：在待研究的兩個(gè)蛋白間沒有發(fā)生相互作用的情況下，報(bào)告基因仍被激活。(1)．高敏感性。8）條帶彎曲：電泳過程產(chǎn)熱過多；染色、固定時(shí)間短。 3）根據(jù)電荷的不同分離：； 。：(1)凝膠層的不連續(xù)性：濃縮膠 (stacking gel)； 分離膠 (separating gel)(2)緩沖液離子成分的不連續(xù)性：快離子(前導(dǎo)離子, leading ion)；慢離子(尾隨離子, trailing ion)；緩沖配對(duì)離子(緩沖抗衡離子,the buffer counter ion)。(4). 離心、層析、電泳等進(jìn)一步純化。 注意事項(xiàng)：石英比色杯；調(diào)零所用溶液；配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白所用溶液；光密度范圍。2）P53蛋白作為“基因警衛(wèi)”負(fù)責(zé)維持基因組的完整性、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。10. Bcl2家族對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制:(1)BclBax和Bclx組成一個(gè)凋亡調(diào)控系統(tǒng)。(3).分類：百余種凋亡調(diào)控因子，正逐漸被組裝成一條條的信息傳導(dǎo)通路，可分為基本傳導(dǎo)通路和非專一性傳導(dǎo)通路二類。第三代遺傳標(biāo)記是SNP（restriction fragment length polymorphism，單核苷酸多態(tài)性），不再是分析長(zhǎng)度，而是直接測(cè)序2）物理圖:以一段已知序列的DNA片段（STS，sequence tagged site，序列標(biāo)記位點(diǎn)）并有染色體定位為路標(biāo)，以Mb或Kb為圖距的基因組圖。（二）轉(zhuǎn)錄與翻譯不同步，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子，功能相關(guān)基因分散排布，無操縱子結(jié)構(gòu)。（五） 基因多為不連續(xù)的，被插入序列（IS）所分隔(這種現(xiàn)象稱為斷裂基因（split gene）. 斷裂基因由內(nèi)含子（intron）（非編碼序列）和外顯子（exon）（編碼序列）交替組成。如果比較隨機(jī)的十個(gè)人的常染色體的非編碼區(qū),就會(huì)發(fā)現(xiàn)約200~400bp就有一個(gè)核苷酸不同,這些可變區(qū)域即稱為DNA多態(tài)性 (DNA polymorphism)位點(diǎn)。(3)細(xì)胞核凋亡誘導(dǎo)途徑。(in situ end –lableing, ISEL)：原理: ISEL的原理是基于細(xì)胞凋亡時(shí)，DNA斷裂，利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）或DNA聚合酶將帶有生物素標(biāo)記的核苷酸（biotin16dUTP）摻入到斷裂的DNA的3’端，再使其與帶有辣根過氧化物酶的抗生物蛋白結(jié)合，經(jīng)DAB顯色后，便可觀察到細(xì)胞內(nèi)是否存在DNA片段端存在。三、細(xì)胞周期調(diào)控：：1）間期：G1期 (合成前期)； S期 (DNA合成期)； G2期 (合成后期)。 缺點(diǎn)：對(duì)各種純化蛋白質(zhì)反應(yīng)不同；這種測(cè)定方法對(duì)蛋白質(zhì)引起不可逆的變性。4. 包涵體的形成原因：表達(dá)蛋白不適當(dāng)?shù)闹虚g折疊體高濃度聚集在一起形成的不溶物。在濃縮膠與分離膠之間有pH的不連續(xù)性，是為了控制慢離子的解離度，從而控制其有效遷移率。：1）分配層析柱象分餾柱一樣可以分成很多層，每層為一理論塔板，其高度為理論塔板高度。 五、酵母細(xì)胞雙雜交系統(tǒng)：1）酵母雙雜交；2）親和層析；3）免疫共沉淀；4）蛋白質(zhì)交聯(lián)；5）基于GFP的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的研究方法；6）噬菌體顯示系統(tǒng)篩選。檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，作用條件與作用力無需模擬，在一定