【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 活性降低。 　　 混勻反應(yīng)體系后,將eppendorf管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?37℃水浴保溫23小時(shí),使酶切反應(yīng)完全。 　　 每管加入2μl (),混勻,以停止反應(yīng),置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?　　二、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的制備 　　采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段來作為電泳時(shí)的分子量標(biāo)準(zhǔn)。λDNA為長(zhǎng)度約50kb的雙鏈DNA分子,酶解反應(yīng)操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8個(gè)片段, , , , , , 。EcoRI切割lDNA后得到6個(gè)片段,長(zhǎng)度 , , , , 。 　　三、 瓊脂糖凝膠的制備 　　 取5TBE緩沖液20ml加水至200ml,TBE稀釋緩沖液,待用。 　　 膠液的制備：,置于200ml錐形瓶中,加入50ml TBE稀釋緩沖液,放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時(shí)搖動(dòng),使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜,以減少水份蒸發(fā)。 　　 膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。 向冷卻至5060℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB) /ml(也可不把EB加入凝膠中,)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè),待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi),使膠液形成均勻的膠層。倒膠時(shí)的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現(xiàn)氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應(yīng)樣品槽附近會(huì)有一些隆起,阻礙緩沖液進(jìn)入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應(yīng)注滿緩沖液。 　　 加樣：取10μl酶解液與2μl 6載樣液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低,則可依上述比例增加上樣量,但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個(gè)樣品要更換tip頭,以防止互相污染,注意上樣時(shí)要小心操作,避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。 　　 電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?080V,電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí),停止電泳。 　　 染色：,室溫下染色2025分鐘。 　　 觀察和拍照：在波長(zhǎng)為254nm的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩,以免損傷眼睛。 經(jīng)照相機(jī)鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機(jī)固定于照相架上，采用全色膠片，,曝光時(shí)間10120秒(根據(jù)熒光條帶的深淺選擇)。 　　 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：在放大的電泳照片上,以樣品槽為起點(diǎn),用卡尺測(cè)量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的遷移距離,以厘米為單位。以核苷酸數(shù)的常用對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),以遷移距離為橫坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪出連結(jié)各點(diǎn)的平滑曲線,即為該電泳條件下DNA分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 　　 DNA酶切片段大小的測(cè)定：在放大的電泳照片上,用卡尺量出DNA樣品各片段的遷移距離,根據(jù)此數(shù)值,在DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的對(duì)數(shù)值,進(jìn)一步計(jì)算出各片段的分子量大小(若用單對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,則可根據(jù)遷移距離直接查出DNA片段的大小)。反之,若已知DNA片段的大小亦可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它預(yù)計(jì)的遷移距離。 　　 DNA酶切片段排列順序的確定：根據(jù)單酶切,雙酶切和多酶切的電泳分析結(jié)果,對(duì)照DNA酶切片段大小的數(shù)據(jù)進(jìn)行邏輯推理,然后確定各酶切片段的排列順序和各酶切位點(diǎn)的相對(duì)位置。以環(huán)狀圖或直線圖表示,即成該DNA分子的限制性內(nèi)切酶圖譜。 　　[注意] ，否則DNA溶液中其他成分會(huì)干擾酶反應(yīng)。 　　酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在最適反應(yīng)條件下，1小時(shí)完全降解1mg lDNA的酶量為一個(gè)單位，但是許多實(shí)驗(yàn)制備的DNA不象lDNA那樣易于降解，需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)。 　　市場(chǎng)銷售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見，使用時(shí)可事先用酶反應(yīng)緩沖液（1）進(jìn)行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10之下，否則，酶活性將受影響。 　　 觀察DNA離不開紫外透射儀,可是紫外光對(duì)DNA分子有切割作用。從膠上回收DNA時(shí),應(yīng)盡量縮短光照時(shí)間并采用長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈(300360nm）,以減少紫外光切割DNA。 　　 EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性,配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套,并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。 　　 當(dāng)EB太多,膠染色過深,DNA帶看不清時(shí),可將膠放入蒸餾水沖泡,30分鐘后再觀察。 第三章 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化第一節(jié) 概 述 　　在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi),但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中,一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因,因此不能自行完成從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA?！　∞D(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 　　轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化學(xué)試劑法)的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenent cells)。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant,即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞)。目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高,但CaCl2 法簡(jiǎn)便易行,且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求,制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí),可加入占總體積15％的無菌甘油于70℃保存(半年),因此CaCl2法為使用更廣泛。為了提高轉(zhuǎn)化效率, 實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素： 　　1. 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于４℃的培養(yǎng)菌，最好從－70℃或20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通過監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600 來控制。DH5α菌株的OD600 ,細(xì)胞密度在5107 個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時(shí)比較合適。密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。　　2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí),轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。1ng的cccDNA即可使50μl （ng=109）的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。 　　3. 試劑的質(zhì)量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是最高純度的(.),并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。 　　4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染, 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。 　　 DH5a菌株為受體細(xì)胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態(tài),然后與pBS質(zhì)粒共保溫,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pBS質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr )，可通過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pBS，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。能在Amp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了pBS。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定?！　?DH5a菌株為受體細(xì)胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態(tài),然后與pBS質(zhì)粒共保溫,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pBS質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr )，可通過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pBS，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。能在Amp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了pBS。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。 第二節(jié) 材料、設(shè)備及試劑 　　一. 材料　　E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS質(zhì)粒DNA: 購買或?qū)嶒?yàn)室自制，eppendorf管。 　　二. 設(shè)備 　　恒溫?fù)u床,電熱恒溫培養(yǎng)箱,臺(tái)式高速離心機(jī),無菌工作臺(tái),低溫冰箱, 恒溫水浴鍋, 制冰機(jī), 分光光度計(jì),微量移液槍。 　　三. 試劑 　　：配方見第一章。 　　：配方見第一章。 　　:將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60℃左右,加入Amp儲(chǔ)存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻后鋪板。 　　(Maconkey Agar):取52g麥康凱瓊脂,加蒸餾水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高壓滅菌，待冷至60℃左右加入Amp儲(chǔ)存液使終濃度為50ug/ml,然后搖勻后涂板。 　　: CaCl2(無水,分析純),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌?！　?: CaCl2(無水,分析純),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。 第三節(jié) 操作步驟 　　一、 受體菌的培養(yǎng) 　　從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α單菌落,接種于35ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)左右,直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。將該菌懸液以1:1001:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)23小時(shí)至OD600 ＝。 　　二、 感受態(tài)細(xì)胞的制備 ( CaCl2 法) 　　將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10分鐘,然后于4℃下3000g離心10分鐘?！　?棄去上清,冰上放置1530分鐘后,4℃下3000g離心10分鐘。 　　棄去上清,加入4ml預(yù)冷含15%,輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液?！　?感受態(tài)細(xì)胞分裝成200μl的小份,貯存于70℃可保存半年。 　　三、 轉(zhuǎn)化 　　從70℃冰箱中取200μl感受態(tài)細(xì)胞懸液,室溫下使其解凍,解凍后立即置冰上?！　?加入pBS質(zhì)粒DNA溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘后。 　　42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘,熱擊后迅速置于冰上冷卻35分鐘。 　　向管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基(不含Amp),混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí),使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài),并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。 　　將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時(shí),待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37℃培養(yǎng)1624小時(shí)。 　　同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照: 　　對(duì)照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應(yīng)沒有菌落出現(xiàn)。 　　對(duì)照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時(shí)只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。 　　四、 計(jì)算轉(zhuǎn)化率 　　統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。 　　轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長(zhǎng)出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計(jì)算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下： 　　轉(zhuǎn)化子總數(shù)＝菌落數(shù)稀釋倍數(shù)轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積／涂板菌液體積 　　轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子數(shù)／每mg質(zhì)粒DNA）＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／質(zhì)粒DNA加入量(mg) 　　感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)＝對(duì)照組２菌落數(shù)稀釋倍數(shù)菌液總體積／涂板菌液體積 　　感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／感受態(tài)細(xì)胞總數(shù) 　　[注意] 。但它們的轉(zhuǎn)化效率并不一定一樣。有的轉(zhuǎn)化效率高，需將轉(zhuǎn)化液進(jìn)行多梯度稀釋涂板才能得到單菌落平板,而有的轉(zhuǎn)化效率低,涂板時(shí)必須將菌液濃縮(如離心),才能較準(zhǔn)確的計(jì)算轉(zhuǎn)化率。 第四章 RNA的提取和cDNA合成第一節(jié) 概 述 　　從真核生物的組織或細(xì)胞中提取mRNA,通過酶促反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈,將雙鏈cDNA和載體連接,然后轉(zhuǎn)化擴(kuò)增, 即可獲得cDNA文庫,構(gòu)建的cDNA文庫可用于真核生物基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)和調(diào)控的分析。比較cDNA和相應(yīng)基因組DNA序列差異可確定內(nèi)含子存在和了解轉(zhuǎn)錄后加工等一系列問題。總之cDNA的合成和克隆已成為當(dāng)今真核分子生物學(xué)的基本手段。自70年代中葉首例cDNA克隆問世以來,已發(fā)展了許多種提高cDNA合成效率的方法,并大大改進(jìn)了載體系統(tǒng)，目前cDNA合成試劑已商品化。cDNA合成及克隆的基本步驟包括用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈,聚合酶合成cDNA第二鏈,加入合成接頭以及將雙鏈DNA克隆到于適當(dāng)載體(噬菌體或質(zhì)粒)?！　∫?、RNA制備　　模板mRNA的質(zhì)量直接影響到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),容易受RNA酶的攻擊反應(yīng)而降解,加上RNA酶極為穩(wěn)定且廣泛存在,因而在提取過程中要嚴(yán)格防止RNA酶的污染,并設(shè)法抑制其活性,這是本實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。所有的組織中均存在RNA酶,人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實(shí)驗(yàn)過程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小時(shí)以上。%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理,再用蒸餾水沖凈。DEPC是RNA酶的化學(xué)修飾劑,它和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會(huì)產(chǎn)生致癌物,因而使用時(shí)需小心。試驗(yàn)所用試劑也可用DEPC處理