【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 染野生型大腸桿菌ung + 結(jié)果含U的模板在尿嘧啶脫糖苷酶的作用下發(fā)生鏈的斷裂而被破壞。硫代磷核苷酸誘變法：限制性核酸內(nèi)切酶 AvaⅠ， AvaⅡ ， BanⅢ， HindⅡ， NciⅠ， PstⅠ，PvuⅠ等不能切割有硫代磷核苷酸衍生物取代正常核苷酸形成的DNA。 用硫代磷核苷酸,在DNA聚合酶催化和DNA連接酶作用下，形成異源dsDNA分子，再用NciⅠ消化該異源dsDNA分子，可獲的高效率的定點(diǎn)突變分子。 PCR定點(diǎn)突變重疊延伸PCR誘變：用PCR法各擴(kuò)增兩條帶有預(yù)設(shè)突變堿基的DNA片段，擴(kuò)增的DNA片段在預(yù)設(shè)突變處有重疊區(qū)域，混合重疊片段，并與兩個(gè)原始片段互補(bǔ)的側(cè)翼引物進(jìn)行第三次PCR擴(kuò)增，以獲得全長(zhǎng)DNA。需兩個(gè)突變誘導(dǎo)引物，兩個(gè)側(cè)翼引物，3次PCR。誘變率極高大引物PCR定點(diǎn)誘變：兩輪PCR，2個(gè)側(cè)翼引物，其中一個(gè)為預(yù)設(shè)突變引物，第一輪PCR后，大引物不需純化，第一輪退火溫度較低，第二輪較高（72℃）特點(diǎn)：簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)，平均誘變效率可達(dá)80％第十三章 腫瘤相關(guān)基因癌基因(oncogene，onc.)：是指細(xì)胞或病毒中存在的，能誘導(dǎo)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化的基因，并參與細(xì)胞的生長(zhǎng)與代謝。這些基因在正常情況下不表達(dá)或僅限量表達(dá)，當(dāng)其被激活時(shí)則可引起癌變，通常將病毒中的這類(lèi)癌基因稱(chēng)為病毒癌基因(vonc)，細(xì)胞中存在的癌基因稱(chēng)為細(xì)胞癌基因(conc),由于conc在正常細(xì)胞中以非激活狀態(tài)存在，故又稱(chēng)為原癌基因(protoonc). 原癌基因：未激活的細(xì)胞癌基因在人體正常細(xì)胞中存在是一種正常基因作用，可調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，廣泛存在于生物界中，從酵母到人的細(xì)胞中都存在。病毒癌基因 （vonc） 存在于病毒基因組的癌基因稱(chēng)為病毒癌基因。它不編碼病毒的結(jié)構(gòu)成分，對(duì)病毒的復(fù)制也沒(méi)有作用，但其異常表達(dá)可以使宿主細(xì)胞持續(xù)增殖, 產(chǎn)生腫瘤或使培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成癌細(xì)胞的動(dòng)物病毒基因。細(xì)胞癌基因（conc）存在于正常細(xì)胞基因組的癌基因稱(chēng)為細(xì)胞癌基因（conc）。在正常細(xì)胞內(nèi)可以表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化的功能。只有在一定的條件下發(fā)生改變而有過(guò)度表達(dá)時(shí)，才可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān),正常狀態(tài)下為非活化形式即原癌基因（proonc）：病毒癌基因轉(zhuǎn)錄效率高；細(xì)胞癌 基因轉(zhuǎn)錄效率低。：病毒癌基因無(wú)內(nèi)含子；細(xì)胞癌基因有內(nèi)含子。：病毒癌基因表達(dá)蛋白常缺失C 端，轉(zhuǎn)化功能加強(qiáng)。 : 病毒癌基因?qū)Σ《颈旧頍o(wú)關(guān)緊要，卻可使宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化，引起腫瘤，而細(xì)胞癌基因?qū)?xì)胞的生長(zhǎng)、分化和功能活動(dòng)卻是至關(guān)緊要的癌基因的激活機(jī)理 1. 點(diǎn)突變：原癌基因在射線或化學(xué)致癌劑作用下，可能發(fā)生單個(gè)堿基的替換導(dǎo)致點(diǎn)突變，從而改變了表達(dá)蛋白的氨基酸組成，造成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)異常。 點(diǎn)突變常見(jiàn)于ras癌基因ras基因的表達(dá)產(chǎn)物RAS是一種小分子G蛋白，在信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用， ras基因的點(diǎn)突變主要發(fā)生在第113和61位密碼子，正常RAS的作用因其自身的GTP酶活性而受到嚴(yán)格控制，而突變了的RAS其GTP酶活性下降或喪失，失去了原有控制，致使增殖信號(hào)持續(xù)作用，細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。 ras基因的點(diǎn)突變可導(dǎo)致多種腫瘤： Hras點(diǎn)突變導(dǎo)致膀胱癌、甲狀腺癌、宮頸癌、肺癌 K ras點(diǎn)突變導(dǎo)致結(jié)腸癌、肺腺癌、胰腺癌、膽管癌 N ras點(diǎn)突變導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、急性淋巴母細(xì)胞白血病等 ：插入具有高活性的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，使原癌基因持久、過(guò)量地表達(dá) n 逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR含較強(qiáng)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。雞淋巴細(xì)胞瘤由于白細(xì)胞增生病毒（ALV）的LTR插入 cmyc 的旁側(cè)（5′或3′端），使cmyc的表達(dá)比正常高30100倍 3. 基因擴(kuò)增 基因拷貝數(shù)的增加稱(chēng)為基因擴(kuò)增。原癌基因擴(kuò)增使轉(zhuǎn)錄模板增加，mRNA的水平增高，表達(dá)活性增加，產(chǎn)生過(guò)量的表達(dá)蛋白而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生?；驍U(kuò)增導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)異常：雙微小染色體，無(wú)著絲粒，4. 染色體易位 原癌基因在腫瘤細(xì)胞中從染色體正常位置轉(zhuǎn)移到其他某個(gè)位置上稱(chēng)為染色體易位。易位導(dǎo)致原來(lái)無(wú)活性的原癌基因移至啟動(dòng)子或增強(qiáng)子附近而激活。 易位后失去原旁側(cè)的抑制性調(diào)節(jié)作用，使其表達(dá)增強(qiáng)。 不同的癌基因有不同的激活方式，一種癌基因也可有幾種激活方式。例如cmyc的激活就有基因擴(kuò)增和基因重排兩種方式，很少見(jiàn)cmyc的突變；而ras的激活方式則主要是突變，各種癌基因之間存在協(xié)同作用,腫瘤的發(fā)生是多步驟，多因素的，不同的癌基因作用于腫瘤發(fā)生的不同階段。 抑癌基因：一類(lèi)抑制細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)、增殖，從而遏制腫瘤形成，當(dāng)其缺失或變異抑癌功能喪失導(dǎo)致腫瘤生成的基因，也稱(chēng)為腫瘤抑制基因或隱性癌基因。抑癌基因的主要功能：調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng) 抑制細(xì)胞增殖 誘導(dǎo)終末分化和細(xì)胞凋亡 維持基因穩(wěn)定 抑制蛋白激酶活性 改變DNA甲基化酶活性 調(diào)節(jié)組織蛋白酶活性 Rb基因 位于人13號(hào)染色體q14,全部序列約200 kb,含27個(gè)外顯子, 該mRNA編碼分子量為105kD ,故被稱(chēng)之為P105蛋白，能與DNA結(jié)合。Rb基因的作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期 pRB具有兩種形式: 磷酸化與非磷酸化 非磷酸化的P105為非活性型, 可抑制細(xì)胞增殖，磷酸化的P105為活性型可促進(jìn)細(xì)胞增殖Rb基因?qū)δ[瘤的抑制作用與轉(zhuǎn)錄因子E2F有關(guān)E2F是一類(lèi)激活轉(zhuǎn)錄作用的活性蛋白，控制著S期的重要蛋白質(zhì)的合成（如DNA合成酶），在G0、G1期，低磷酸化型的Rb蛋白與E2F結(jié)合成復(fù)合物，使E2F處于非活化狀態(tài)；在S期，Rb蛋白被磷酸化而與E2F解離，E2F變成游離狀態(tài)，細(xì)胞立即進(jìn)入增殖階段。當(dāng)Rb基因發(fā)生缺失或突變，喪失結(jié)合、抑制E2F的能力，于是細(xì)胞增殖活躍，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。p53基因 定位 ，長(zhǎng)20kb,有11個(gè)外顯子，10個(gè)內(nèi)含子。外顯子1不編碼。8分別編碼五個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域（ⅠⅤ）：1319，117143，171181，236258，270286。 mRNA，編碼生成393個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為53kD。 P53蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)可分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域： 216。 N端1780肽段為酸性區(qū)，具有轉(zhuǎn)錄因子活性，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。 216。 102292肽段為DNA結(jié)合區(qū)，能與DNA特異序列結(jié)合，結(jié)合時(shí)需要Zn2+參與。 216。 C端300393肽段為p53四聚體結(jié)合部位，該部位除與p53四聚體結(jié)合外，與DNA非特異結(jié)合也有關(guān)。 P53的生物學(xué)功能： 抑制細(xì)胞增殖 P53基因時(shí)刻監(jiān)控著基因的完整性，一旦細(xì)胞DNA遭到損害，P53蛋白與基因的 DNA相應(yīng)部位結(jié)合，起特殊轉(zhuǎn)錄因子作用，活化 p21基因轉(zhuǎn)錄，P21蛋白與cyclinE/CDK2結(jié)合抑制該激酶的活性和其對(duì)PRb的磷酸化，使細(xì)胞停滯于G1期。 P53蛋白與復(fù)制因子A相互作用參與DNA的損傷修復(fù)；如果修復(fù)失敗，P53蛋白即啟動(dòng)程序性死亡過(guò)程誘導(dǎo)細(xì)胞自殺，阻止有癌變傾向突變細(xì)胞的產(chǎn)生，從而防止細(xì)胞惡變。促進(jìn)DNA損傷修復(fù)： 當(dāng)DNA因各種物理、化學(xué)因素引起DNA損傷時(shí)， P53蛋白與受損DNA部位結(jié)合，起特殊轉(zhuǎn)錄因子的作用，活化GADD45基因轉(zhuǎn)錄修復(fù)DNA。 GADD45蛋白與CDK3和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)結(jié)合形成復(fù)合體（ CDK3/ GADD45蛋白/PCNA），促進(jìn)DNA修復(fù)。 GADD45蛋白也可以P21/CDK/ GADD45蛋白/PCNA四聚體形式，促使DNA修復(fù) P53蛋白還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：當(dāng)DNA損傷不能修復(fù)時(shí)，P53可誘導(dǎo)Bax基因表達(dá) ， 形成Bax / Bax 復(fù)合體，因Bax基因具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 另外，當(dāng)DNA損傷時(shí)，細(xì)胞表達(dá)p53 mRNA而導(dǎo)致GADD45基因表達(dá)水平升高，使細(xì)胞的生長(zhǎng)停止或凋亡。 第十四章 基因診斷和基因治療基因診斷：應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù),從DNA/RNA水平檢測(cè)分析致病基因的存在,變異和表達(dá)狀態(tài)從而對(duì)疾病作出診斷的技術(shù) 二、基因診斷的特點(diǎn)針對(duì)性強(qiáng)： 以探測(cè)疾病基因?yàn)槟繕?biāo)，屬于“病因診斷” 。 特異性高： 以分子雜交技術(shù)為基本原理 靈敏度高： 基因探針帶有十分敏感的檢測(cè)標(biāo)記，可從人類(lèi)長(zhǎng)達(dá)3106kb的基因組中檢測(cè)出某一基因的單堿基改變。而且待測(cè)標(biāo)本微量。適應(yīng)性強(qiáng)：其應(yīng)用的范圍已從原先局限的遺傳性疾病擴(kuò)大到感染性疾病、腫瘤、心血管疾病等領(lǐng)域。 基因探針可為任何來(lái)源，任何種類(lèi)，探針序列可為已知亦可未知，檢測(cè)目標(biāo)可為內(nèi)源基因亦可外源基因，診斷范圍廣。早期診斷：基因診斷不僅可對(duì)有表型出現(xiàn)的疾病作出明確診斷，它還可在產(chǎn)前早期診斷遺傳性疾病，可檢出感染疾病潛伏期的病原微生物、還可預(yù)測(cè)和早期發(fā)現(xiàn)某些惡性腫瘤?；蛟\斷的基本流程：制備基因探針； 提取目的基因，獲得單鏈DNA； PCR擴(kuò)增DNA； 目的DNA與尼龍膜結(jié)合； 探針與目的DNA互補(bǔ)配對(duì)； 沖洗尼龍膜； 檢測(cè)雜合分子基因診斷的基本技術(shù) 一、核酸分子雜交（hybridization）根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，將樣品DNA/RNA雙鏈經(jīng)變性處理，加入已標(biāo)記的單鏈DNA/RNA探針，樣品中與探針互補(bǔ)的DNA/RNA序列可與探針形成雜交雙鏈DNA，通過(guò)顯示標(biāo)記物或其它方法來(lái)檢測(cè)特定的核酸片段。 分子雜交技術(shù)過(guò)程： 探針制備及標(biāo)記（同位素或非同位素） 待測(cè)核酸樣品制備（分離，純化）雜交（液相，固相）雜交后處理（去掉非特異雜交分子）顯示結(jié)果（顯色，發(fā)光，放射自顯影） 結(jié)果分析分子雜交的基本方法 原位雜交 不須提取DNA或RNA。直接用培養(yǎng)/采集的細(xì)胞（涂載玻片上）、組織切片（固定載玻片上）和細(xì)菌菌落（復(fù)印至濾膜上）與標(biāo)記核酸探針雜交。可測(cè)知特定基因的存在或表達(dá)狀況。還可觀察被測(cè)基因在細(xì)胞內(nèi)或染色體上的定位。斑點(diǎn)印跡雜交 把提取的DNA/RNA樣本，直接點(diǎn)到硝酸纖維膜或尼龍膜上與標(biāo)記核酸探針雜交。通過(guò)纖維素膜雜交斑點(diǎn)的放射自顯影或膠片斑點(diǎn)的光吸收值掃描可以測(cè)定待檢核酸的含量?？蓹z測(cè)特定基因的存在或表達(dá)情況。Southern 印跡雜交 將制備的DNA經(jīng)酶切電泳、再轉(zhuǎn)印到固相支持物上，用探針雜交后進(jìn)行檢測(cè)的方法，用于 DNA/DNA雜交。該方法主要用于檢測(cè)基因組中待測(cè)的基因或序列Northern 印跡雜交 檢測(cè)RNA（主要是mRNA）的方法PCR 基本原理－DNA復(fù)制 167。 三個(gè)步驟：變性(denaturation) 退火(annealing)延伸(extension)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP) 限制性核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別特定的DNA序列，并在其中的某一特定堿基位點(diǎn)（限制性位點(diǎn)）將DNA切斷，使 DNA形成限制性片段.RFLP技術(shù)診斷疾病的機(jī)理:由于基因突變的結(jié)果,使DNA上原有的核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列發(fā)生改變,導(dǎo)致使用限制酶去切割時(shí)得到的結(jié)果與不發(fā)生突變的結(jié)果完全不同,:某些遺傳性疾病發(fā)生特異的點(diǎn)突變,而點(diǎn)突變位置正好是某些酶的識(shí)別和切割點(diǎn),可用酶切方法做出診斷.1. 點(diǎn)多態(tài)性 表現(xiàn)為DNA鏈中發(fā)生單堿基突變，且突變導(dǎo)致一個(gè)原有酶切位點(diǎn)的丟失或形成一個(gè)新的酶切位點(diǎn)。據(jù)此，樣品DNA經(jīng)特定內(nèi)切酶消化或Southern印跡雜交即可診斷某些疾病。 n 2. 序列多態(tài)性 DNA鏈內(nèi)發(fā)生較大片段的缺失、重復(fù)、插入等變異。結(jié)果，內(nèi)切酶位點(diǎn)本身堿基序列雖未改變，但原有內(nèi)切酶位點(diǎn)在基因組中的相對(duì)位置改變了從而導(dǎo)致RFLP。也可用Southern印跡雜交診斷相關(guān)疾病。 基因芯片(Gene chip, DNA chip),又稱(chēng)為DNA微陣列(DNA Microarray)，是指固定在載體上的高密度DNA微點(diǎn)陣。具體地說(shuō)就是將已知DNA片段或cDNA片段作為探針，緊密有序地排列固定于支持物（多聚賴(lài)氨酸硅膠）上，然后與熒光標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿与s交信號(hào)的強(qiáng)度，獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。限制性?xún)?nèi)切酶譜分析法( RE )等位基因特異寡核苷酸探針( ASO ) 原理：針對(duì)已知突變位點(diǎn)的基因：可以分別針對(duì)已知突變位點(diǎn)的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)寡核苷酸探針，其中一條為野生型探針，