分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(編輯修改稿)
2025-05-01 23:13 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 I，BamH I，內(nèi)切酶緩沖液（10），10電泳加樣緩沖液5．實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 配制TAE電泳緩沖液（50180。儲(chǔ)存液），1000180。溴化乙錠儲(chǔ)存液（），10180。加樣緩沖液，（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）6．操作步驟（1）：pMD18TF DNA (或pUCmTF ) 6 μL10酶切緩沖液（用EcoRI的緩沖液） 2 μLdd water 30 μLEcoRI 1μLBamHI 1μL總體積 40μL（2）先準(zhǔn)備一個(gè)冰盒并放入一定量的冰塊。從20℃冰柜中取出限制性?xún)?nèi)切酶，立即插入冰塊中。（3）用一只手的手指捏在盛放酶的微量離心管的上部（以免手指的給酶液加溫），另一只手持微量移液器，小心翼翼地吸取1 μL限制性?xún)?nèi)切酶。（4）在酶切樣品混合液中加入限制性?xún)?nèi)切酶后（立即把內(nèi)切酶原液送回冰柜?。?，輕輕震動(dòng)微量離心管使管中的溶液混勻。再在離心機(jī)中1000rpm離心10秒。取出后插到水漂的孔中，在推薦的最適酶切溫度水浴中溫育13 h（一般是 37℃）。（5）酶切后取少量酶切產(chǎn)物與合適的已知分子量的DNA（如先前的PCR產(chǎn)物）對(duì)比電泳，以確認(rèn)切下的片斷是否為自己想要的片斷。（6）酶切后的質(zhì)粒可以回收備用。（7）清理桌面垃圾，清洗實(shí)驗(yàn)儀器。撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。7．思考 （1）酶切反應(yīng)混合物的體積是否對(duì)酶切效果有影響？為什么？ （2）如何估計(jì)DNA用量和酶的用量？ （3）在吸取內(nèi)切酶的時(shí)候如何操作才能別免浪費(fèi)？實(shí)驗(yàn)三、 質(zhì)粒DNA的PCR擴(kuò)增1．目的學(xué)會(huì)PCR操作的基本技術(shù)。2．原理 是將待擴(kuò)增的DNA模板加熱變性，與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡聚核苷酸引物復(fù)性，然后經(jīng)過(guò)耐熱的DNA聚合酶延伸。再進(jìn)入下一輪變性—復(fù)性—延伸的循環(huán)，n次循環(huán)后DNA可被擴(kuò)增（1+X）n倍。其中25nt的引物退火溫度Tm=2（A+T）+4（G+C）。3．器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭， PCR微量管，雙面微量離心管架，PCR儀，臺(tái)式離心機(jī)，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，水漂，恒溫水浴。4．試劑 3U/μl Taq DNA聚合酶，PCR緩沖液（10，MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP，引物，模板質(zhì)粒pMD18TF，無(wú)菌dd water。 5．實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 dNTP混合液（每種25mM），TAE電泳緩沖液，100
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