【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 作為宿主菌。　 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容　　　試劑與材料　　　 1．菌株 DH5a等。　　　 2．重組質(zhì)粒 pNTEGFP。　　　 3．100mmol／L CaCl2，用純水配制?！? 4．氨芐青霉素(100mg／m1)，用無(wú)菌水配制并過(guò)濾()除菌，濾液于20℃冰箱中保存?！　? 5．LB平板 ％瓊脂粉，高壓消毒(15磅20min)，稍冷卻后鋪平板?！　? 6．含抗生素LB平板 配方同上，高壓消毒后，冷卻至65℃左右，加入氨芐青霉素，終濃度為50～100μg／m1培養(yǎng)液，加入抗生素后立即倒平板?！　　? 7．培養(yǎng)皿及1．5ml離心管等。　　操作步驟　　　1. 將DH5a細(xì)菌接種在LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜?！　　?．從LB平板上挑取DH5a單個(gè)菌落接種在5ml LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。　　　 3． ，接種于50 ml新鮮LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)OD600=；4℃10min,然后4℃ 4000r／min離心8min，棄去上清液。　 4. 沉淀的菌體懸浮于20m1 ／L冷CaCl2內(nèi)，冰浴中放置30min，4℃4000r／min離心8 min。　　 5．沉淀的菌體再懸浮于2m1 ／L冷CaCl2溶液，并置于冰浴中?！? （%的無(wú)菌甘油70℃保存）　6．取3支1．5ml離心管，按下表加試劑和操作：　試 劑　　管1　　管2　　　管3　　連接產(chǎn)物　10μl　　　　　質(zhì)粒(100ng／μ1)　　　　　　1μl　　H2O　　　　　　9μl　　10μl　　　感受態(tài)細(xì)胞　　200μl　　　200μl　　　200μl　　　 7．冰浴中放置30min?！? 8．42℃熱沖擊90s后，立即放入冰浴,放置2－5分鐘。　 9．。　 10．37℃劇烈振搖培養(yǎng)60min。（轉(zhuǎn)速不低于225RPM）　　 11．5000r／min離心1min, 棄去上清液保留培養(yǎng)基100～200μl，充分懸浮細(xì)菌，分別涂布于含氨芐青霉素的LB平板，加入的菌液用玻棒均勻推開。以上操作均需在無(wú)菌條件下進(jìn)行。平板在37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜。次日觀察各平板上菌落生長(zhǎng)情況，并算出轉(zhuǎn)化率即每微克DNA能轉(zhuǎn)化多少個(gè)細(xì)菌?！　　∽⒁馐马?xiàng)　　 1．致敏緩沖液中試劑的純度與濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率影響很大，試劑必須為分析純，同時(shí)，致敏緩沖液最好避光貯存于40C?！　? 2．制備感受態(tài)細(xì)胞的全部操作均須于冰浴低溫操作，同時(shí)注意無(wú)菌操作，防止感受態(tài)細(xì)胞受雜菌污染?！　　?．42℃熱處理時(shí)間很關(guān)鍵，轉(zhuǎn)移速度要快，且溫度要準(zhǔn)確，同時(shí)注意熱處理過(guò)程中離心管不要搖動(dòng)?！　　?．菌液涂皿操作時(shí)，應(yīng)避免反復(fù)來(lái)回涂布，因?yàn)楦惺軕B(tài)細(xì)菌的細(xì)胞壁有了變化，過(guò)多的機(jī)械擠壓涂布會(huì)使細(xì)胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率。　5．實(shí)驗(yàn)用的玻璃器皿、微量吸管及Eppendorf管等，應(yīng)徹底洗凈并進(jìn)行高壓消毒，表面去污劑及其他化學(xué)試劑的污染往往大幅度地降低轉(zhuǎn)化率?！　舅伎碱}】??？如何提高轉(zhuǎn)化率？　　　？　　　 　　　　　實(shí)驗(yàn)六 PCR擴(kuò)增基因特異片段　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模骸? 學(xué)習(xí)PCR體外擴(kuò)增的原理及其引物設(shè)計(jì)原則；了解擴(kuò)增過(guò)程中各因素對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響；掌握PCR的基本操作。　實(shí)驗(yàn)原理　 PCR(polymerase chain reaction)是在體外進(jìn)行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴(kuò)增反應(yīng)。在分子生物學(xué)研究中，廣泛地應(yīng)用于研究基因突變，獲取加上酶切位點(diǎn)的目的基因和DNA序列測(cè)定等方面，是分子生物學(xué)中一項(xiàng)極為常用的技術(shù)?！? PCR的原理是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸(dNTP)存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應(yīng)。兩個(gè)引物分別位于靶序列的兩端，同兩條模板的3＇端互補(bǔ)，由此限定擴(kuò)增片段。PCR反應(yīng)由一系列的變性——退火——延伸反復(fù)循環(huán)構(gòu)成，即在高溫下模板雙鏈DNA變性解鏈，然后在較低的溫度下同過(guò)量的引物退火，再在適中的溫度下由DNA聚合酶催化進(jìn)行延伸。由于每一循環(huán)的產(chǎn)物都可作為下一循環(huán)反應(yīng)的模板，因此擴(kuò)增產(chǎn)物的量以指數(shù)級(jí)方式增加。理論上，經(jīng)過(guò)n次循環(huán)可使特定片段擴(kuò)增到2n1，考慮到擴(kuò)增效率不可能達(dá)到100％，實(shí)際上要少些，通常經(jīng)25～30次循環(huán)可擴(kuò)增106倍，這個(gè)量足夠分子生物學(xué)研究的一般要求?！? (一)PCR引物設(shè)計(jì)　 1．Tm值 Tm值是PCR引物設(shè)計(jì)中的一個(gè)重要參數(shù)，是指引物與模板之間精確互補(bǔ)并且在模板過(guò)量的情況下有50％的引物與模板配對(duì)，而另外50％的引物處于解離狀態(tài)時(shí)的溫度，Tm值一般高于55℃。合適的引物選擇應(yīng)需考慮到以下因素，如Taq酶的最適溫度(TE)和Tm值等。最常用的Taq酶的最適溫度(TE)范圍為70～74℃，根據(jù)TE可以先確定一個(gè)合適的退火溫度范圍(Ta)。這個(gè)溫度范圍應(yīng)不高于酶的最適反應(yīng)溫度，也不能比TE－25℃更低。這是因?yàn)槿绻嘶饻囟鹊陀诿傅淖钸m反應(yīng)溫度時(shí)，酶的合成反應(yīng)會(huì)非常緩慢，但片面考慮提高溫度又會(huì)造成引物脫落而不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所以Ta的選擇應(yīng)滿足TE25℃TaTE?！　　? 2．引物的長(zhǎng)度 引物長(zhǎng)度一般在15～30個(gè)核苷酸之間比較合適。引物過(guò)短時(shí)造成Tm值過(guò)低，不能與模板很好地配對(duì)或是配對(duì)專一性很低。引物過(guò)長(zhǎng)時(shí)又會(huì)造成Tm值過(guò)高，超過(guò)酶的最適反應(yīng)溫度，還使合成引物的費(fèi)用大大增加。當(dāng)然若要在引物的5＇末端加上特定的酶切位點(diǎn)等堿基則可稍長(zhǎng)?！　　? 3．引物的GC％含量 引物的GC比最好設(shè)計(jì)在40％～60％的范圍內(nèi)。GC比過(guò)高與過(guò)低都會(huì)直接造成Tm值的過(guò)高與過(guò)低。如上所述，Tm值的估計(jì)可簡(jiǎn)單地根據(jù)經(jīng)驗(yàn)式Tm＝4GC+2AT+℃獲得?！　　? 4．引物3′端起始?jí)A基 Taq酶在3′末端錯(cuò)配時(shí)延伸效率是不一樣的，延伸效率為TG＝CA。即當(dāng)引物3′末端為A時(shí)，即使有錯(cuò)配堿基也最不易延伸，所以引物設(shè)計(jì)時(shí)可將3′末端設(shè)計(jì)為A，以提高復(fù)制精確性。另一種理論是3′末端應(yīng)設(shè)計(jì)為G或C，因?yàn)镚和C的氫鍵多于A與T，能更好地與模板結(jié)合開始DNA合成，當(dāng)然對(duì)錯(cuò)配延伸效率方面就不能苛求了?？偠灾?，引物的3′末端不要考慮使用T?！　? 5．引物無(wú)發(fā)卡結(jié)構(gòu) 引物自身應(yīng)無(wú)發(fā)卡結(jié)構(gòu)?！　? 6．二引物自身之間不能配對(duì) 二引物自身不能配對(duì)是指同一對(duì)引物之間不能有配對(duì)的多個(gè)堿基，特別是在引物的3′末端。二引物間不能配對(duì)的道理與二引物本身不能配對(duì)相同，若發(fā)生這種情況會(huì)形成引物二聚體，造成擴(kuò)增失敗。一般引物自身配對(duì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對(duì)數(shù)不大于3，兩條引物間配對(duì)堿基數(shù)小于5個(gè)?！　?．二引物的Tm值 引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)注意使二引物的Tm值相近，否則二個(gè)引物必然不能同時(shí)達(dá)到最佳退火溫度，將會(huì)影響PCR擴(kuò)增效果。能同時(shí)達(dá)到最佳退火溫度，將會(huì)影響PCR擴(kuò)增效果。由于影響引物設(shè)計(jì)的因素比較多，所以常利用計(jì)算機(jī)來(lái)輔助設(shè)計(jì)，通常可用primer 。　　 (二)PCR反應(yīng)條件　　　 1．PCR緩沖液 常用的1PCR緩沖液為10mmol／L TrisHCl (常溫)，50mmol／L KCl，／L MgCl2。由試劑公司與Taq酶一起提供?！　　? (1)Mg2+離子濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR反應(yīng)影響很大，因?yàn)閇Mg2+]與引物模板及產(chǎn)物的解鏈溫度、產(chǎn)物的特異性、引物二聚體的生成、產(chǎn)物的忠實(shí)性、酶活力、產(chǎn)物的產(chǎn)量等諸多因素有關(guān)。Mg2+～／L，／L梯度間隔做Mg2+最適濃度試驗(yàn)?！　　? (2)dNTP：常用dNTP濃度為20μmol／L(可用范圍為20～200μmol／L)。dNTP的用量與PCR產(chǎn)量及產(chǎn)物忠實(shí)性有關(guān)，dNTP量過(guò)少時(shí)合成的產(chǎn)物減少?？梢员籘aq酶接受的經(jīng)過(guò)修飾的dNTP有以下幾類：dig11dUTP、5—bromodUTP、biotin11—dUTP、biotin16—dUTP、7—deazadGTP和次黃嘌呤。但不是所有的聚合酶都能接受經(jīng)過(guò)修飾的dNTP?！? (3)K+離子濃度：PCR反應(yīng)中K+離子的作用是促進(jìn)Taq酶活力與促進(jìn)引物退火，一般使用濃度是50mmol／L，但當(dāng)K+離子濃度高于50mmol／L時(shí)會(huì)抑制Taq酶活力。　 (4)pH值：PCR反應(yīng)中用的是TrisHCL緩沖系統(tǒng)。TrisHCL緩沖系統(tǒng)的特點(diǎn)是具有很高的溫度系數(shù)(／℃)，20℃℃延伸反應(yīng)時(shí)，實(shí)際pH值降低至7．2。而Tricine的溫度系數(shù)較高，在擴(kuò)增長(zhǎng)片段時(shí)用Tricine系統(tǒng)?！? (5)保護(hù)劑：由于PCR反應(yīng)體系中蛋白的含量極低，所以加人的酶非常容易變性，通常需加入一定量的保護(hù)劑。如5mmol／L的二硫蘇糖醇(DTT)，100μg／ml的小牛血清白蛋白(BSA)％的明膠。加入保護(hù)劑對(duì)PCR循環(huán)數(shù)較多的擴(kuò)增反應(yīng)效果尤其明顯?！?．模板 PCR模板可以是DNA或RNA，RNA需反轉(zhuǎn)錄后再擴(kuò)增。模板可以是基因組DNA或純化的質(zhì)粒DNA，當(dāng)然兩者的DNA量在PCR起始模板中相差很大。每個(gè)PCR反應(yīng)中加入的模板數(shù)量可在102～105分子之間，必要時(shí)可低至50個(gè)分子，模板的量少時(shí)應(yīng)酌情增加循環(huán)次數(shù)。小于100ng的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA(相當(dāng)于約104個(gè)細(xì)胞)，經(jīng)30個(gè)循環(huán)，10％的反應(yīng)物應(yīng)能夠在溴化乙錠染色的凝膠上看到一條主要產(chǎn)物帶。使用較大量的模板時(shí)，循環(huán)數(shù)可減少；如果模板量很少，可能需要增加至45個(gè)循環(huán)反應(yīng)?！?．引物濃度 ～／L。隨著引物濃度的降低，PCR反應(yīng)的特異性提高但產(chǎn)物得率降低；隨著引物濃度的升高，情況正好相反?！? 4．PCR反應(yīng)中的酶 Taq酶最早是從水生嗜熱菌(thermus aquaticus)中分離得到的，該酶的最適溫度是72℃，在94℃時(shí)相當(dāng)穩(wěn)定，半衰期長(zhǎng)達(dá)38min。由于這種酶使用最早最廣泛，文獻(xiàn)中所列各項(xiàng)最適反應(yīng)條件都是針對(duì)此酶優(yōu)化的，使用其它的聚合酶時(shí)按試劑盒使用說(shuō)明書操作?！?shí)驗(yàn)內(nèi)容　　　儀器和試劑　1．儀器 PCR儀，微型水平電泳槽，電泳儀等?！　　?．試劑?。?）50TAE電泳緩沖液　　　?。?）10PCR緩沖液：　　?。?）4種dNTP混和液　　10mmol/L?。?）Pfu DNA聚合酶　?。?U/μl）?。?）引物（20μM）　　　　（6）10溴酚藍(lán)上樣緩沖液　　　　方法和步驟　　1. 在PCR儀上設(shè)置好程序。　2. ，按下列順序加樣，建立20μl反應(yīng)體系?！　dH20　　　15μl　　10PCR Buffer　　2μl　　　dNTP(10mM each)　　　　　Primer l(20μM)　　　　Primer 2(20μM)　　　　模板DNA (50ng)D16　Pfu DNA聚合酶（） 　　1μl　　　　　　總體積 20μl　　　　對(duì)照水（空白對(duì)照）　 3．混勻，短暫離心． 　4．放在PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。94℃變性3min，94℃45秒，64℃ 1分鐘，72℃3分鐘，20個(gè)循環(huán)。（用舊式的PCR儀進(jìn)行基因擴(kuò)增時(shí)還要求覆蓋約50μl (一滴)液體石蠟油，改進(jìn)后的PCR儀已經(jīng)不用液體石蠟油覆蓋。）　　　5 . 取5μl PCR反應(yīng)液及1μl上樣緩沖液混合，進(jìn)行瓊脂糖電泳(5V／cm)，選擇適當(dāng)大小的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000），檢查擴(kuò)增產(chǎn)物。紫外觀察，必要時(shí)拍照?！∽⒁馐马?xiàng)　　　，因此，在進(jìn)行PCR前，模板的純化和引物設(shè)計(jì)尤為重要。　　+對(duì)Taq DNA聚合酶的活性影響很大，有時(shí)按照試劑商提供的說(shuō)明擴(kuò)增不出目的基因時(shí)，不妨適當(dāng)增加Mg2+的濃?！　舅伎碱}】　1. PCR的原理是什么？　2. PCR中引物和TaqDNA聚合酶各有什么作用？　　　3. PCR中怎樣預(yù)防出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果？　　　 4. 什么是Tm值？有何用途？如何計(jì)算？　 5. 引物設(shè)計(jì)應(yīng)遵循什么原則？　 6. 你會(huì)使用哪種引物設(shè)計(jì)軟件？　　　　　　　　　實(shí)驗(yàn)七 DNA片段的回收及純化　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹　? 了解瓊脂糖凝膠電泳中回收DNA片段的常用方法，掌握根據(jù)實(shí)際情況選用方法的原則，并用試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物DNA片段?！　?shí)驗(yàn)原理　　　 DNA片段的分離與回收是基因工程操作中一項(xiàng)重要的技術(shù)，例如可收集特定酶切片段用于克隆或是制備探針，回收PCR產(chǎn)物用于再次鑒定等?；厥諏?shí)驗(yàn)中兩個(gè)最重要的技術(shù)指標(biāo)是產(chǎn)物的純度與回收率：純度未達(dá)標(biāo)時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響以后的酶切、連接、標(biāo)記等酶參與的反應(yīng)；回收率不理想時(shí)往往會(huì)大大增加前期工作量?！　　? 1．低熔點(diǎn)膠法 低熔點(diǎn)膠是向普通瓊脂糖的多糖鏈上引入羥乙基形成的，這一變化會(huì)使凝膠的熔化點(diǎn)與凝固點(diǎn)均降低。低熔點(diǎn)膠在30℃時(shí)凝結(jié)、65℃時(shí)熔化，這一溫度尚不足以使DNA分子變性。操作時(shí)可先灌一塊普通的膠，然后用低熔點(diǎn)膠取代其中的回收部分。割下的膠加入TE后于65℃保溫促使凝膠熔化，再加入等體積的酚抽提去除凝膠。低熔點(diǎn)膠的另一個(gè)特點(diǎn)是電泳回收后可以立即進(jìn)行酶切連接、標(biāo)記等酶反應(yīng)，因?yàn)檫@類膠中不含有普通瓊脂糖中抑制酶活性的硫酸鹽等雜質(zhì)，并且收集的膠條能在酶反應(yīng)的合適溫度(37℃)始終保持液體狀態(tài)。　 2．玻璃粉(乳)法 將膠條割下加入NaI溶液浸泡，劇烈振蕩數(shù)分鐘促使溶膠。向膠液中加入經(jīng)酸凈化處理的極細(xì)玻璃粉(乳)，室溫反復(fù)倒轉(zhuǎn)離心管使DNA吸附于其上。離心收集玻璃粉后加入TE并于37℃保溫，洗脫吸附于玻璃粉上DNA，再次離心收集含DNA的上清液即可。～1kb的小分子片段，均有80％的回收率?！? 3．QIAgen膠回收試劑盒 由于凝膠溶于含NaI的溶膠液，DNA能專一地與離心柱中纖維素結(jié)合。結(jié)合后的DNA經(jīng)洗滌除去雜質(zhì)，最后在低鹽緩沖液中經(jīng)離心從纖維素上洗脫下來(lái)。　　 4 其他試劑盒，本實(shí)驗(yàn)采用的是北京塞百盛生物技術(shù)公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒?；驹硎?，在高鹽狀態(tài)下，純化樹脂專一性地吸附DNA；而在低鹽或水溶液狀態(tài)下，D