【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 核酸擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序 每次實(shí)驗(yàn)除了待檢標(biāo)本，還要包括一個(gè)陰性對(duì)照、一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照、一個(gè)陽(yáng)性室內(nèi)質(zhì)控品。 PCR 儀電源開關(guān)，儀器自檢完成后再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。 （僅適用于梯度 PCR 儀）：利用上下箭頭選擇“ option” 鍵→ “ enter” →根據(jù)所需要的溫度選擇 “ T” 和 “177?！睖囟龋⒂霉P記下相應(yīng)的溫度梯度→“ exit” →選擇“ stander” 程序→ “ enter” →編寫相應(yīng)的程序，并選擇相應(yīng)的溫度梯度→“ exit” → “ save no” → “ exit” →打開儀器蓋子，放入裝有反應(yīng)體系的 Eppendorf 管，蓋上蓋子，按“ start”鍵 →運(yùn)行完相應(yīng)程序→打開儀器蓋子，取出 Eppendorf 管，蓋上蓋子→關(guān)機(jī)。 3. 編寫 PCR 運(yùn)行程序：利用上下箭頭選擇“ files” 鍵→ “ edit” → “ enter” →編寫相應(yīng)的程序→ “ exit” → “ save yes” → 用數(shù)字或字母編寫相應(yīng)的程序名稱→ “ enter” → “ exit” 。 34 PCR 運(yùn)行程序：利用上下箭頭選擇“ files” 鍵→ “ load” → “ enter” →選擇相應(yīng)的程序→“ exit” → “ save no” → “ exit”→ 打開儀器蓋子，放入裝有反應(yīng)體系的 Eppendorf 管，蓋上蓋子，按“ start” 鍵 →運(yùn)行完相應(yīng)程序→打開儀器蓋子，取出Eppendorf 管，蓋上蓋子→關(guān)機(jī)。 4. 瓊脂糖電泳檢測(cè) PCR 產(chǎn)物 35 十五、 PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)操作程序 1. 目的： PCR檢測(cè)是整個(gè)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)最主要的過程，為使該過程有序、在控，特制訂本程序。 2. 范圍： PCR 檢測(cè) 樣本處理、核酸提取、純化、擴(kuò)增產(chǎn)物分析整個(gè)過程。 3. 職責(zé)： 本程序由 PCR實(shí)驗(yàn)室工作人員負(fù)責(zé)執(zhí)行。 4. 工作流程： 核酸提取、純化、擴(kuò)增、產(chǎn)物分析的具體操作見項(xiàng)目 SOP文件及儀器使用 SOP文件。 注：目前， SOP 文件的主要依據(jù)是生產(chǎn)廠家提供的檢測(cè)試劑盒說明書。 核酸提取由 Trizol一步法在樣本制備間完成。 提取和純化后的核酸樣品由傳遞窗轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增間的模板添加工作區(qū)。 擴(kuò)增反應(yīng)體系的配制、分裝在模板添加區(qū)完成后，由傳遞窗中取出待測(cè)樣品，添加模板后，上機(jī)操作。 擴(kuò)增程序的編程：日常檢測(cè)活動(dòng)中，操作者必須遵循儀器按SOP文件規(guī)定的路徑，根據(jù)實(shí)驗(yàn)試劑盒要求和工作經(jīng)驗(yàn)。編程或修改路徑參照儀器說明書；編程或修改的文件經(jīng)臨床 36 實(shí)驗(yàn)診斷中心主任審核批準(zhǔn)后方能執(zhí)行，原文件作廢收回。 標(biāo)本標(biāo)識(shí)的傳遞： 檢測(cè)過程中 以標(biāo)本唯一性標(biāo)識(shí)中的 “序號(hào)”為一一對(duì)應(yīng)的“工作序號(hào)”進(jìn)行傳遞。 試管或其它蓋體分離的容器，檢驗(yàn)號(hào)標(biāo)識(shí)于管身上 1/3 處。 對(duì)于 Eppendoff 管，檢驗(yàn)號(hào)標(biāo)識(shí)于管蓋。 擴(kuò)增使用的反應(yīng)板的標(biāo)識(shí)、檢驗(yàn)號(hào)由試管架上的標(biāo)識(shí)傳遞到反應(yīng)板上，并且一一對(duì)應(yīng)。 工作安排：每 一項(xiàng)目每周至少完成一個(gè)批次的檢測(cè)。 在移取所需體積的骨髓后，立即蓋緊原始標(biāo)本管蓋，將標(biāo)本繼續(xù)保存于 4℃ 冰箱。 原始標(biāo)本在檢驗(yàn)分析結(jié)果報(bào)告后至少保存一周才能清除 . 如患者及醫(yī)生對(duì)標(biāo)本結(jié)果有異議，則需在檢測(cè)一周內(nèi)及時(shí)提出意見，以便重新檢測(cè)復(fù)核結(jié)果。 37 十六、 PCR試驗(yàn)記錄的管理 ： 檢驗(yàn)資料是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量證明資料及質(zhì)量體系運(yùn)作依據(jù)的重要組成部分。為使資料的記錄、保存狀態(tài)在控，特制訂本文件。 ： 本程序適用于實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)、文本資料的記錄和保存，主要有：病人 和標(biāo)本信息、實(shí)驗(yàn)操作記錄、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果、原始檢測(cè)申請(qǐng)單和檢測(cè)報(bào)告單、儀器使用記錄等，實(shí)驗(yàn)記錄包括電子記錄和文本記錄。 分區(qū)的專門文件夾中（如 D:\PCR），保存路徑要清晰、便捷、易查找。 ：一整年的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均保存在一個(gè)年度文件夾里，如“ 2020年”文件夾；每個(gè)年度文件夾又包含 12 個(gè)月文件夾，如“ 9 月”、“ 10 月”，每天的實(shí)驗(yàn)結(jié)果就保存在當(dāng)月文件夾里。 件保存時(shí)以當(dāng)天日期命名，如 2020 年 9月 10 日的保存為 。 ，須保存多個(gè) SDS 文件，命名時(shí)在后面以 a、 b、 c 等字母標(biāo)識(shí)，如 2020年 9月 10 日做的兩次實(shí)驗(yàn)，分別保存為 。 、硬件故障等問題 38 導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果丟失、無法查詢等情況，每個(gè)月的實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄文件都要用移動(dòng)存儲(chǔ)設(shè)備（如軟盤、 USB硬盤等）拷貝到另一部 PC 機(jī)上做備份；一年的數(shù)據(jù)要用刻錄機(jī)刻制一張 CD 光盤備份 儲(chǔ)存，貼上標(biāo)簽，如“ 2020年實(shí)驗(yàn)結(jié)果備份”。放入檔案柜妥善存放。 ： ：在專用實(shí)驗(yàn)記錄簿上記載，不同實(shí)驗(yàn)區(qū)的記錄簿不得混用。試劑貯存區(qū)記錄檢測(cè)所用的試劑盒情況（名稱、批號(hào)、數(shù)量）和自配試劑記錄；標(biāo)本制備區(qū)記錄檢測(cè)標(biāo)本數(shù)及在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行的操作過程；在擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)記錄質(zhì)控結(jié)果和分析。 ，至少 2 年以上；其它實(shí)驗(yàn)記錄保存于各自實(shí)驗(yàn)操作區(qū)內(nèi)，至少保存 2 年以上。 ，需使用黑色墨 水筆，字跡清晰，不得隨意涂改，如確需更改，應(yīng)在原更改內(nèi)容上劃雙線，填上新內(nèi)容，并簽名。 ，不得給他人借閱或復(fù)印（涉及醫(yī)療糾紛處理除外）。在記錄借出時(shí)需有實(shí)驗(yàn)室主管、經(jīng)手人、借閱人的簽名方可。 ，由實(shí)驗(yàn)室主管交科里統(tǒng)一保存。 ，要記錄病人和標(biāo)本信息，包括：病人姓名、性別、 39 年齡、 ID、檢驗(yàn)單申請(qǐng) ID 號(hào)、病區(qū)床號(hào)、檢測(cè)項(xiàng)目、標(biāo)本類型、標(biāo)本狀態(tài)、送檢日期、標(biāo)本接收人姓名等。連同實(shí)驗(yàn)得到檢測(cè)結(jié)果，當(dāng)天工作結(jié)束前打印出當(dāng)天的病人、標(biāo)本 信息及檢測(cè)結(jié)果匯總表，存檔，保存至少 2 年以上。 40 十七、 PCR 檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告程序 1． 目的： 檢測(cè)報(bào)告是檢驗(yàn)過程的最終輸出，為使報(bào)告的生成、發(fā)放、管理受控，特制訂本程序。 2． 報(bào)告人： 趙李昊等。 3． 審核人： 潘曉東等。 4． 職責(zé)： PCR檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告的審核、發(fā)放、管理、查詢和意見的反饋。 將病例資料、樣品資料、檢測(cè)結(jié)果錄入報(bào)告系統(tǒng)，產(chǎn)生結(jié)果報(bào)告單，經(jīng)本室組長(zhǎng)或 經(jīng)相關(guān)培訓(xùn)后獲得上崗資格的工作人員及 高年資檢驗(yàn)人員審核簽名后交工友送門診和各病區(qū)。 5. 報(bào)告內(nèi)容 科室名稱 檢測(cè)項(xiàng)目 樣本接收和檢驗(yàn)日期 病人的信息（姓名、性別、年齡、門診或住院病區(qū)及床號(hào)） 檢驗(yàn)方法（如 TaqMan熒光定量 PCR檢測(cè)法） 結(jié)果 定性 檢測(cè)項(xiàng)目檢測(cè)陰性或陽(yáng)性 定量 檢測(cè)項(xiàng)目檢測(cè)陽(yáng)性、檢測(cè)量為 檢測(cè)人 對(duì)檢測(cè)結(jié)果按標(biāo)準(zhǔn)要求作出報(bào)告。 簽發(fā)日期、姓名。 41 專業(yè)負(fù)責(zé)人 對(duì)報(bào)告結(jié)果進(jìn)行審核，審核日期、姓 名。 6． 工作流程： 要求：檢測(cè)報(bào)告結(jié)果進(jìn)入服務(wù)器保存，并涵蓋滿足臨床隨時(shí)查詢、查詢結(jié)果按本實(shí)驗(yàn)室操作。 在檢驗(yàn)報(bào)告發(fā)生遺失的特殊情況下，查明發(fā)生問題的環(huán)節(jié)后，決定是否重新補(bǔ)發(fā)報(bào)告。補(bǔ)發(fā)的報(bào)告應(yīng)注明補(bǔ)發(fā)的原因，并在補(bǔ)發(fā)報(bào)告單上作補(bǔ)發(fā)記錄。 在現(xiàn)有條件下，目前暫不考慮使用電子文件的形式發(fā)放檢測(cè)報(bào)告，患者若有類似要求，可在標(biāo)本送檢時(shí)，提交與病歷一致的通信地址，檢驗(yàn)報(bào)告以掛號(hào)形式發(fā)出。 實(shí)驗(yàn)室在接受電話查詢時(shí)，關(guān)于檢驗(yàn)結(jié)果僅能回答 “某日送檢的某個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)已經(jīng)完成（或未完成）。結(jié)果請(qǐng)到服務(wù)臺(tái)領(lǐng)取 ”，不得在無有效證據(jù)的情況下以任何方式提供諸如某人做過某項(xiàng)檢查和 /或檢測(cè)結(jié)果的信息（包括提示性、暗示性語言）。本院或掛鉤單位的醫(yī)護(hù)人員工作查詢除外。 7. 引用文件： PCR檢測(cè)結(jié)果報(bào)告單見樣單。 42 十八、試劑質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)操作程序 負(fù)責(zé)人：陳必成 ： 保證每批用于臨床實(shí)驗(yàn)的試劑質(zhì)量良好，符合要求。 ： 各種用于臨床實(shí)驗(yàn)的核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑。 ，目測(cè)試劑是否處在凍存狀態(tài)。 ：外包裝（廠名廠址、檢測(cè)項(xiàng)目、批準(zhǔn)文號(hào)、批號(hào)和有效期等 ）；內(nèi)包裝（試劑瓶完整性、真空包裝完整性、試劑品種完整性、使用說明書有否等）。 － 20℃冰箱保存。將上述檢測(cè)核對(duì)情況在記錄本上登記。 ，按如下要求對(duì)新批號(hào)試劑進(jìn)行校驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 1。 1： 在使用前批次試劑進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)的同時(shí)帶上少量新批次的試劑。用新批次試劑做陰性對(duì)照和陽(yáng)性室內(nèi)質(zhì)控品，重復(fù) 5 次實(shí)驗(yàn)，若陰陽(yáng)性及室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果均正常的話，可初步通過驗(yàn)收。 若出現(xiàn)陰性漲、室內(nèi)質(zhì)控品不漲或結(jié)果偏差太大等情況時(shí)要求對(duì)新批號(hào)試劑進(jìn)行校驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 2。 2： ：空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各一，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品梯度（ 10 10 10 108）。 43 ，判斷為試劑不合格，不能用于臨床檢測(cè)： 。如擴(kuò)增曲線 CT 值大于 27，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)確證試劑污染。 ，或陽(yáng)性對(duì)照未檢出而陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品檢出率大幅下降，表示試劑失效或檢測(cè)靈敏度大幅下降。 ，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)正常，提示標(biāo)本提取液可能存在問題。重復(fù)新舊提取液 陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，確定提取液失效問題。更換提取液后該批試劑方可使用。 ，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。單獨(dú)用提取液點(diǎn)樣上機(jī)，出現(xiàn)擴(kuò)增，需更換提取液后方可使用該批試劑。 對(duì)照檢出，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品未檢出或擴(kuò)增曲線明顯系統(tǒng)性 CT值偏大 5個(gè)循環(huán)以上。提示陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品存在問題。更換陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品后該批試劑方可投入使用。 44 十 九 、實(shí)驗(yàn)耗材的購(gòu)買、質(zhì)檢和儲(chǔ)存 程序 ： 保證耗材的使用質(zhì)量，合理的配用及存放。 ： 核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室常用耗材： 管、 離心管、 、帶濾芯的吸頭。 、質(zhì)量規(guī)格報(bào)相關(guān)部門訂貨及購(gòu)買。 ，驗(yàn)收合格即領(lǐng)取。 、定量地?cái)[在實(shí)驗(yàn)臺(tái)抽屜里，并標(biāo)明品名及數(shù)量。特殊的消耗品放在指定的地方。 ，應(yīng)準(zhǔn)確查詢數(shù)量。 ，存放要小心，以免 損壞。 離心管 :檢查離心管有無畸形、破損、不能閉蓋的情況。 :每批隨機(jī)抽樣 離心管 50 個(gè)用于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。 50 個(gè)目測(cè)合格的離心管蓋好蓋插在浮板上置于沸水浴鍋中 20 分鐘后取出，如發(fā)現(xiàn)有爆開情況發(fā)生，即認(rèn)為該批離心管不符合本實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)要求，作退貨處理。 50 個(gè)離心管加半量生理鹽水后， 1 萬轉(zhuǎn) /分離心 20分鐘，如發(fā)現(xiàn)有管蓋爆開或漏液情況發(fā)生，即認(rèn)為該批離心管不符合本實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)要求，作退貨處理。 ，即啟用該批耗材。 45 離心管 方法、步驟同上。 檢 查吸頭有無畸形、破損。 :每批隨即抽樣吸頭 50 個(gè)用于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。 ，看有無吸孔堵塞、漏氣現(xiàn)象發(fā)生，在排除移液器因素后，如有異常發(fā)現(xiàn)，即認(rèn)為該批吸頭不符合本實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)要求，作退貨處理。 ，即啟用該批耗材。 備注： 實(shí)驗(yàn)耗材在目測(cè)合格后基本上都可以初步通過驗(yàn)收。如果在目測(cè)不合格或目測(cè)合格后出現(xiàn)甚至頻繁出現(xiàn)爆管、堵塞、漏液、漏氣等情況下，再由實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。 46 二十、實(shí)驗(yàn)室的清潔程序 責(zé)任人：鄭建建 一、 目的：防止實(shí)驗(yàn)室內(nèi)污染。 二、 范圍：整個(gè) PCR實(shí)驗(yàn)室。 三、 職責(zé)： PCR實(shí)驗(yàn)室人員必須明確造成污染的來源及處理辦法。 四、 工作程序： 1. 實(shí)驗(yàn)前對(duì)各區(qū)空間，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面等及走廊進(jìn)行紫外線消毒 30 分鐘并做好記錄。 2. PCR 室人員在操作過程必須戴手套、口罩、帽子。 3. 離心管在使用前要經(jīng)高溫消毒滅菌。 4. 未消毒的物品放置標(biāo)本接收室，滅菌過的物品先放置試劑室，在滅菌有效期內(nèi)由傳遞窗傳至各區(qū)。 5. 已滅菌的離心管在取用時(shí)須用專用鑷子夾取，不允許用手去拿。 6. 試驗(yàn)過程如發(fā)生液體外瀉，應(yīng)立即用浸有 10％次氯酸 鈉溶液的衛(wèi)生紙覆蓋污染處半小時(shí)，再用浸有 75％酒精的軟布擦拭干凈，然后用移動(dòng)紫外車紫外照射并記錄。 7. 實(shí)驗(yàn)用過的 Tip頭、離心管的處理見廢棄物處理程序。 8. 每次工作結(jié)束后，用 75％的酒精清潔移液槍一次。使用過的試管架，凈化臺(tái)，工作臺(tái)面用 10％次氯酸鈉擦拭 1 遍后，再用 75％的酒精清潔 1 遍，然后用紫外線照射 60min以上。 9. 各種用途的鑷子應(yīng)標(biāo)明標(biāo)識(shí)專項(xiàng)專用，用后應(yīng)浸泡在 75%酒精中。 47 Tip 頭等一次性材料污染，應(yīng)立即更換應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)使用過的一次性手套口罩帽子應(yīng)丟入 專用的垃圾袋中。 ，各區(qū)的地面需進(jìn)行清潔，各區(qū)的清潔拖把、抹布等應(yīng)嚴(yán)格分開使用并分開存放，清潔順序按試劑室到擴(kuò)增室進(jìn)行。 ，應(yīng)做好各區(qū)的清潔工作，然后做好實(shí)驗(yàn)后清潔消毒記錄，并將各區(qū)的廢棄物及垃圾袋密封后帶出試驗(yàn)區(qū)，打開該區(qū)紫外燈進(jìn)行消毒 60min以上。 13. 10％次氯酸鈉每 1月配制一次， 75%酒精每周領(lǐng)取一次。