【文章內(nèi)容簡介】 連續(xù)復(fù)制不能復(fù)制線性染色體末端而造成遺傳信息的丟失。端粒酶負(fù)責(zé)端粒DNA的復(fù)制，它帶有與端粒重復(fù)序列互補(bǔ)的RNA分子。該酶在體細(xì)胞中處于抑制狀態(tài)，但在許多癌細(xì)胞中處于激活狀態(tài)。思 考 題與 作 業(yè)什么是半保留機(jī)制, 什么是半不連續(xù)復(fù)制, 復(fù)制的主要過程有哪些?教學(xué)后記這個部分是分子生物學(xué)的重要章節(jié),要講仔細(xì).課　　時　　教　　案講 授 人查幸福課　　時3序　　號6課題內(nèi)容DNA damage, repair and rebination教學(xué)時間教學(xué)方法講授教學(xué)課型理論□ 實(shí)驗(yàn)□ 習(xí)題□實(shí)踐□ 復(fù)習(xí)□ 其它□教學(xué)手段板書、多媒體教學(xué)目的1 了解突變的種類和產(chǎn)生的因素2 理解DNA復(fù)制忠實(shí)性的機(jī)制3 掌握DNA修復(fù)的機(jī)制4 掌握DNA重組的方式及原理重點(diǎn)難點(diǎn)DNA突變、修復(fù)、重組教　學(xué)　內(nèi)　容備　注F1 誘變突變 指DNA堿基序列發(fā)生的永久的可遺傳的改變。一個單一堿基的改變?yōu)辄c(diǎn)突變，它包括轉(zhuǎn)換（嘌呤與嘌呤，嘧啶與嘧啶間的互換）或顛換（嘌呤與嘧啶間的互換）。如果點(diǎn)突變發(fā)生在DNA的非編碼區(qū)、非調(diào)節(jié)區(qū)或密碼子的第3個堿基，它不會影響滲入蛋白質(zhì)中的氨基酸，為沉默突變；如果發(fā)生氨基酸的改變，則為錯義突變。形成新的終止密碼的突變?yōu)闊o義突變，產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。一個或多個堿基的增加或丟失，會引起移碼突變。群體中許多沉默突變及非致死性突變的積累會產(chǎn)生遺傳多態(tài)性。復(fù)制忠實(shí)性 復(fù)制的精確性有3種機(jī)制：互補(bǔ)堿基配對原則（模板鏈和進(jìn)入核苷酸在DNA聚合酶的作用位點(diǎn)正確配對）；聚合酶的3/→5/外切酶活性有校對功能，它能回走從3/端切掉錯配核苷酸，引物是DNA聚合酶發(fā)揮自我校正功能的必要條件；逃脫校對的錯誤可被錯配修復(fù)機(jī)制所糾正。誘變劑 常見的物理誘變劑為紫外線，它引起相鄰嘧啶核苷酸產(chǎn)生嘧啶二聚體?；瘜W(xué)誘變劑種類很多，堿基類似物可改變堿基配對特性，誘發(fā)直接突變（如5—溴尿嘧啶是胸腺嘧啶的類似物）。亞硝酸使胞嘧啶脫氨變成尿嘧啶，引起復(fù)制中A—T向G—C轉(zhuǎn)化。烷化劑能在DNA不同位置加上烷基，造成堿基脫落，經(jīng)修復(fù)才能防止DNA損傷，細(xì)胞對損傷的處理有可能會由于間接誘變而導(dǎo)致突變。直接誘變和間接誘變 DNA中存在穩(wěn)定的、配對特性發(fā)生改變的堿基而導(dǎo)致的突變?yōu)橹苯诱T變；在有些情況下，一些損傷DNA聚合酶為了保證染色體的完整性在損傷對應(yīng)的位點(diǎn)上插入錯誤的堿基，導(dǎo)致間接誘變；突變發(fā)生在損傷的位點(diǎn)上為定點(diǎn)突變，發(fā)生在其它位點(diǎn)為非定點(diǎn)突變。原核生物中轉(zhuǎn)移損傷DNA合成屬于對DNA損傷的SOS反應(yīng)（有時也叫“易錯修復(fù)”）F2 DNA損傷 堿基的損傷和丟失 DNA的一些損傷是自發(fā)的，如胞嘧啶會自發(fā)水解脫氨變?yōu)槟蜞奏?，它會在接下來的?fù)制中與腺嘌呤配對。生理溫度下，哺乳動物的基因組每天約失去10000嘌呤和幾百個嘧啶。許多已改變的堿基會被專一性的DNA糖基化酶所除去，形成無嘌呤和無嘧啶位點(diǎn)或AP位點(diǎn)。氧化性損傷 自由基可攻擊DNA，產(chǎn)生氧化產(chǎn)物造成氧化損傷烷基化 烷化劑為親電化學(xué)試劑，可將烷基加到核酸的各種位點(diǎn)，導(dǎo)致DNA損傷。有些是致死性的，多數(shù)導(dǎo)致間接誘變損傷。聚化加合物 紫外線使相鄰嘧啶，尤其是胸腺嘧啶形成環(huán)丁烷嘧啶二聚體；煤焦油中的苯并芘在肝臟產(chǎn)生的一種產(chǎn)物可與鳥嘌呤殘基共價結(jié)合；芳香族烷化劑、黃曲霉毒素B1均可與DNA共價結(jié)合。F3 DNA修復(fù)光復(fù)活 DNA中的嘧啶二聚體可通過可見光的光解作用而恢復(fù)為單體，催化此過程的酶是DNA光解酶（光復(fù)活酶）。：蝶呤和FAD。這是一種無差錯的“直接修復(fù)”。烷基轉(zhuǎn)移酶 該酶可直接從突變的O6—烷基鳥嘌呤上除去烷基，酶作用后即失活。它也屬于無差錯直接修復(fù)。切除修復(fù) 為普遍的無差錯的修復(fù)機(jī)制。有兩種形式：核苷酸切除修復(fù)（，缺口可由DNA聚合酶Ⅰ和連接酶填補(bǔ)）；堿基切除修復(fù)（專一的DNA糖基化酶識別修飾堿基，切除修飾堿基與糖基間的N—糖苷鍵，留下一個脫嘌呤或脫嘧啶的AP位點(diǎn)，AP內(nèi)切核酸酶在該位點(diǎn)切開DNA。錯配修復(fù) 是一種特殊的切除修復(fù)，它是按模板的遺傳信息來修復(fù)錯配堿基的，因此修復(fù)時首先要區(qū)別模板鏈和新合成的DNA鏈。它通過堿基的甲基化來實(shí)現(xiàn)的。大腸桿菌DNA的5/—GATC序列中A的N6都是甲基化的（Dam甲基化酶負(fù)責(zé)），復(fù)制后的一個短暫時間內(nèi)，新合成鏈的GATC中的A 未被甲基化，故子代DNA暫時是半甲基化的，這是識別的基礎(chǔ)。錯配的堿基被MutS和 MutL組合的復(fù)合體識別并與之結(jié)合，再與 MutH內(nèi)切核酸酶結(jié)合，后者在子代鏈GATC附近的位點(diǎn)上產(chǎn)生缺刻，啟動對損傷區(qū)的切除修復(fù)。遺傳性非息肉結(jié)腸癌就是一種錯配修復(fù)酶突變丟失引起的。著色性干皮?。╔P）患者缺乏對紫外線引起的大塊DNA損傷的切除功能，對陽光極度敏感，易患皮膚癌F4 重組同源重組 也稱一般重組，即兩個雙螺旋DNA分子間同源序列進(jìn)行交換。雙倍體真核生物發(fā)生在減數(shù)分裂過程，非姐妹染色單體交換相對應(yīng)的區(qū)域，產(chǎn)生的單倍體配子會包含父母本兩方的遺傳信息。單倍體細(xì)菌也可重組，如發(fā)生在部分已復(fù)制DNA間或染色體DNA與外源DNA（質(zhì)粒或噬菌體）間。重組的過程和機(jī)制包括斷裂—復(fù)合、異源雙鏈、分支遷移、Holliday結(jié)構(gòu)、拆分（見教材P98圖）。大腸桿菌的核酸酶和RecBCD結(jié)合在 chi序列上并產(chǎn)生切口形成單鏈末端，單鏈DNA被 RecA蛋白包裹，4條單鏈形成Holliday結(jié)構(gòu)。同源重組對DNA修復(fù)也很重要（復(fù)制后修復(fù)或重組修復(fù)）。位點(diǎn)特異性重組 非同源DNA的特異片段間的交換，它是在結(jié)合序列部位由特異的酶來催化斷裂重接，而同源重組則是由能與RecA蛋白結(jié)合的DNA序列隨機(jī)斷裂引發(fā)的。λ噬菌體可將自身基因組插入大腸桿菌染色體的特定位點(diǎn)，噬菌體編碼的整合酶與細(xì)菌編碼的整合宿主因子（IHF）促成重組結(jié)果和λDNA進(jìn)入宿主染色體。λ噬菌體編碼的切除酶被激活時，整合作用發(fā)生逆轉(zhuǎn)，λ—DNA脫離細(xì)菌基因組。在真核生物中，免疫球蛋白有3個基因段編碼重鏈和輕鏈的可變區(qū)：V、D和J。這些基因段間的重組產(chǎn)生大量的不同重鏈和輕鏈基因序列，導(dǎo)致抗體種類的多樣化。轉(zhuǎn)座作用 又稱非常重組，一些短的DNA片段（轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)座元件）可轉(zhuǎn)移進(jìn)基因組的幾乎任何位置。轉(zhuǎn)座子均有兩個結(jié)構(gòu)特征：兩端有20~40bp的反向重復(fù)序列；具有編碼轉(zhuǎn)座酶的基因，該酶催化轉(zhuǎn)座子插入新的位置。（插入序列）是最為簡單的轉(zhuǎn)座子。Tn轉(zhuǎn)座子系列除了轉(zhuǎn)座酶，還攜帶其它基因（如抗性基因），其中的β—內(nèi)酰胺酶可使生物體抗青霉素。酵母中的Ty元件編碼的蛋白與反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶相似，Ty元件兩側(cè)為長末端重復(fù)序列，它先轉(zhuǎn)錄成RNA再反轉(zhuǎn)錄到DNA雙螺旋中，然后插入到其它地方，果蠅的copia轉(zhuǎn)座子與其相似，稱為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。高等真核生物中的一些分散重復(fù)序列（如LINES和SINES）很可能是通過轉(zhuǎn)座作用在基因組內(nèi)傳播的。思 考 題與 作 業(yè) DNA修復(fù)有哪些類型?機(jī)制各是什么?教學(xué)后記DNA修復(fù)機(jī)理用模型來講解會清楚一些。課　　時　　教　　案講 授 人查幸福課　　時3序　　號7課題內(nèi)容Gene manipulation教學(xué)時間教學(xué)方法講授教學(xué)課型理論□ 實(shí)驗(yàn)□ 習(xí)題□實(shí)踐□ 復(fù)習(xí)□ 其它□教學(xué)手段板書、多媒體教學(xué)目的1 了解DNA克隆及常用宿主和載體2 掌握基因組文庫和cDNA文庫3 掌握DNA克隆的一般步驟重點(diǎn)難點(diǎn)DNA克隆策略及其基本方法教　學(xué)　內(nèi)　容備　注G1 DNA克隆概述DNA克隆 將生物體基因組DNA片段作為自主復(fù)制載體的一部分進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制，對其進(jìn)行分離和操作即為DNA克隆。基因組的較小片段連接到一段可以自主復(fù)制的DNA（載體）上，形成重組DNA，帶有重組DNA的宿主細(xì)胞增殖構(gòu)成一群具有遺傳一致性的個體為單克隆。宿主和載體 載體應(yīng)具有整合特性、獨(dú)立復(fù)制特性和易被篩選的選擇標(biāo)志，常用的載體有細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體（λ噬菌體和噬菌體M13）和一些病毒，還有人工改造的載體如黏粒、細(xì)菌人工染色體、酵母人工染色體等。常用宿主有大腸桿菌和酵母菌。亞克隆 將已克隆的DNA片段從一載體向另一載體轉(zhuǎn)移的過程為亞克隆 。它可用來對較大的克隆片段上的較短區(qū)段進(jìn)行仔細(xì)研究。DNA文庫 是一套DNA克隆，它是帶有不同DNA片段的載體在宿主中擴(kuò)增后的產(chǎn)物。由基因組DNA構(gòu)建的為基因組文庫，由細(xì)胞mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA插入載體構(gòu)成cDNA文庫。篩選含有目的基因的克隆通常用DNA探針經(jīng)雜交來測出，并用限制性酶切圖譜來分析DNA片段。G2 質(zhì)粒DNA的制備質(zhì)粒載體 大腸桿菌的質(zhì)粒是染色體外的環(huán)狀DNA，有復(fù)制起點(diǎn)（ori ），能獨(dú)立復(fù)制，含有抗生素抗性基因（bla 或ampr 基因—抗青霉素，tetA基因—抗四環(huán)素）。是常用的載體。質(zhì)粒的制備 堿裂解法最常用：菌體沉淀懸浮于緩沖液中，加入含有SDS的氫氧化鈉溶液使DNA變性RNA水解，再用高濃度pH5的乙酸鉀沉淀變性蛋白質(zhì)和染色體DNA，離心，上清中含質(zhì)粒DNA。用酚抽提法除去殘余蛋白，留在水相中的DNA和RNA可由乙醇沉淀得濃縮并用核糖核酸酶A降解殘余RNA。也可用氯化銫密度梯度離心純化，這是獲的極純的超螺旋質(zhì)粒DNA的最佳方法。G3 限制酶與電泳限制性內(nèi)切核酸酶 細(xì)菌含有限制修飾系統(tǒng)，有兩個主要組分：限制性內(nèi)切核酸酶（識別一小段對稱的DNA序列，在識別位點(diǎn)處切割）和甲基化酶（對細(xì)胞DNA識別序列內(nèi)的C或A加上一個甲基，保護(hù)宿主細(xì)胞DNA不被內(nèi)切酶降解）識別序列 限制性內(nèi)切核酸酶僅識別6bp的回文序列，在該位點(diǎn)酶切DNA形成兩個片段，每個片段有5/ 突出末端（帶磷酸基團(tuán)）和帶游離羥基的3/ 端。黏末端 限制性酶解反應(yīng)產(chǎn)物的突出末端被稱為黏末端，它可與其它任何具有相同突出序列的末端結(jié)合。酶解切割的DNA片段可用溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠電泳來分離。G4 連接、轉(zhuǎn)化、與重組體分析 DNA連接 來自T4噬菌體的連接酶可將目的基因與載體的黏性末端退火堿基斷裂的磷酸二酯鍵閉合。重組DNA分子 目的基因插入載體DNA的酶切位點(diǎn)處形成的環(huán)狀分子為重組DNA分子。轉(zhuǎn)化 重組體進(jìn)入宿主（大腸桿菌）一般采用轉(zhuǎn)化方式，用Ca2+ 處理大腸桿菌，細(xì)胞易吸收外源DNA，這一過程為轉(zhuǎn)化，預(yù)處理的細(xì)胞被稱為感受態(tài)細(xì)胞篩選 感受態(tài)細(xì)胞在瓊脂平板上生長出的克隆大多不含質(zhì)粒，要對含質(zhì)粒的克隆進(jìn)行篩選，通常利用質(zhì)粒含有的抗性基因來篩選。篩選的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行增殖保存和分析。思 考 題與 作 業(yè)DNA克隆的主要過程有哪些?如何鑒定陽性克隆?教學(xué)后記講一些DNA克隆的實(shí)例更能幫助學(xué)生理解課　　時　　教　　案講 授 人查幸福課　　時3序　　號8課題內(nèi)容Cloning vector教學(xué)時間教學(xué)方法講授教學(xué)課型理論□ 實(shí)驗(yàn)□ 習(xí)題□實(shí)踐□ 復(fù)習(xí)□ 其它□教學(xué)手段板書、多媒體教學(xué)目的了解和熟悉常用的適用于各種用途的克隆載體重點(diǎn)難點(diǎn)質(zhì)粒載體的設(shè)計(jì)、噬菌體載體教　學(xué)　內(nèi)　容備　注H1 Design of plasmid vectors (質(zhì)粒載體的設(shè)計(jì))克隆過程中最重要的步驟之一就是鑒別環(huán)化載體分子與重組質(zhì)粒,已形成了許多方便于鑒定的方法。當(dāng)載體分子上具有雙抗生素抗性基因時，就可以用插入片段插入某個抗性基因而使其失活的方式來篩選重組體。質(zhì)粒上的lacZ’基因的插入失活被用來在含有IPTG和Xgal的平板上篩選重組體。多克隆位點(diǎn)即具有多個限制酶酶切位點(diǎn)的一段DNA序列，為選擇限制酶或克隆中所使用的酶提供更多的選擇性。許多載體被設(shè)計(jì)成使插入片段內(nèi)的基因可從強(qiáng)啟動子起始轉(zhuǎn)錄并表達(dá)。如用T7表達(dá)載體。H2 Bacteriophage vectors噬菌體對大腸桿菌的侵染以及隨后的細(xì)胞裂解過程可用來擴(kuò)增克隆的DNA片段。將目的DNA片段連接于侵染所必須的基因的末端，形成重組噬菌體DNA。經(jīng)過包裝與侵染，最后噬菌體斑形成。M13噬菌體在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)以雙鏈環(huán)狀形式復(fù)制，可以像質(zhì)粒一樣操作，但產(chǎn)生的噬菌體顆粒內(nèi)僅含有環(huán)狀ssDNA。H3 Cosmids, YACs and BACs真核生物基因和基因組結(jié)構(gòu)的分析需要比質(zhì)粒和噬菌體更能容納大片段DNA載體。經(jīng)常使用的有黏粒載體、酵母人工染色體和細(xì)菌人工染色體等。H4 Eukaryotic vectors許多基因克隆的應(yīng)用都需要將基因轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞并獲得表達(dá)。轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞可以采用電穿孔、微注射和固體粒子轟擊。經(jīng)常使用的載體有穿梭載體、酵母附加型質(zhì)粒、根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒、桿狀病毒和哺乳動物病毒載體等。思 考 題與 作 業(yè)常用的載體有哪幾類？性質(zhì)、插入片段大小等如何？表達(dá)載體與克隆載體的有哪些不同？教學(xué)后記學(xué)生反應(yīng)內(nèi)容較抽象。課　　時　　教　　案講 授 人查幸福課　　時3序　　號9課題內(nèi)容Gene libraries and screening教學(xué)時間教學(xué)方法講授教學(xué)課型理論□ 實(shí)驗(yàn)□ 習(xí)題□實(shí)踐□ 復(fù)習(xí)□ 其它□教學(xué)手段板書、多媒體教學(xué)目的1 了解基因文庫的種類及區(qū)別2 掌握基因文庫基本的制作方法重點(diǎn)難點(diǎn)基因組文庫、cDNA文庫制作教　學(xué)　內(nèi)　容備　注I1 基因組文庫 基因文庫 某生物不同DNA序列的總集構(gòu)成基因文庫，它包括基因組文庫和cDNA文庫，基因組文庫 的DNA來自基因組，由細(xì)胞mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的互補(bǔ)DNA（ cDNA）構(gòu)成的為 cDNA文庫 。cDNA文庫不包括不能轉(zhuǎn)錄的核基因序列文庫大小 計(jì)算公式見P140基因組DNA 純化的基因組DNA需要用物理剪切或限制性酶解切割成載體適用的片段（15~25Kb或更大）。常用的酶是Sau3A，該酶產(chǎn)生的酶切黏性末端與 BamHI酶解載體產(chǎn)