【文章內容簡介】 物中 DNA的復制特點 （一） DNA的半保留復制（ semiconservative replication） ? 基本概念 ? 1）復制（ replication）：即 DNA的生物合成，以 DNA為模板指導合成相同的 DNA分子，使遺傳信息從親代傳遞到子代的過程。 RNA病毒的遺傳信息儲存于 RNA分子中，可進行 RNA復制并反轉錄合成 DNA。 ? 關于 DNA復制機理的假說有以下三種： 半保留復制假說 全保留復制假說 發(fā)散式復制假說 Semiconservative Conservative Dispersive 實驗證據(jù) （ 1958 Meselson 和 Stahl ）： Matthew Messelson Franklin Stahl ? 半保留復制的實驗依據(jù) ： ? ? 58年 Meselson和 Stahl利用氮標記技術試驗證實： ? ? 含有 15N標記的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌得到15NDNA； ? ? 將 15NDNA轉移到含有 14N標記的培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同代數(shù)時， CsCl密度梯度離心 ,觀察 DNA所處的位置； ? ? 15NDNA的密度比 14NDNA的大，在密度梯度離心時，兩種密度不同的 DNA分布在不同的區(qū)帶。 ? 半保留復制的實驗結果 ： ? ? 15N DNA顯示為一條重密度帶位于離心管的管底。 ? ? 15N DNA和 14N DNA的雜交分子中密度帶。 ? ? 第二代有中密度帶及低密度帶兩個區(qū)帶，這表明它們分別為 15N 14N － DNA和 14N DNA。 ? ? 在 14N培養(yǎng)基中培養(yǎng)代數(shù)的增加，低密度帶增強，而中密度帶逐漸減弱。 ? 半保留復制進一步的實驗證椐 ： ? ? 15NDNA、 14N DNA雜交分子經加熱變性，對于變性前后的 DNA分別進行 CsCl密度梯度離心。結果變性前的雜交分子為一條中密度帶，變性后則分為兩條區(qū)帶，即重密度帶 (15N DNA)及低密度帶 (14N DNA)。 中國科學院上海生化與細胞所 2022年招收碩士研究生分子遺傳學入學考試： 請設計一個實驗來證明 DNA復制是以半保留方式進行的（ 8分）。 “Heavy” DNA “Hybrid” DNA “l(fā)ight” DNA “Hybrid” DNA ? 2）半保留復制（ semiconservative replication）： DNA復制時，親代 DNA雙螺旋結構解開，分別以解開的兩股單鏈為模板，以dNTP(dATP、 dGTP 、 dTTP 、 dCTP)為原料，按照堿基互補的原則，合成與模板鏈互補的新鏈，從而形成兩個子代 DNA雙鏈，其結構與親代 DNA雙鏈完全一致。因子代 DNA雙鏈中的一股單鏈源自親代，另一股單鏈為合成的新鏈，形成的雙鏈與親代雙鏈的堿基序列完全一致，故稱為半保留復制。 DNA半保留復制的生物學意義： 新 DNA分子雙鏈為?一母一子?；因此復制更為精確，致使遺傳信息更加穩(wěn)定。穩(wěn)定的遺傳信息從親代傳遞給子代，從而使生物的前后代保持了一定的連續(xù)性。 （二）與 DNA復制有關的物質 原料： 四種脫氧核苷三磷酸（ dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP) dNTP 模板： 以 DNA的兩條鏈為模板鏈，合成子代 DNA 引物： DNA的合成需要一段 RNA鏈作為引物 ? 引物合成酶（引發(fā)酶）： 是一種 RNA聚合酶，在復制的起始點處以 DNA為模板，催化合成一小段互補的 RNA。實質是以 DNA為模板的 RNA聚合酶。 DNA聚合酶不能催化兩個游離的 dNTP聚合反應，若沒有引物就不能起始 DNA合成。 引物酶能直接在單鏈 DNA模板上催化游離的 NTP合成一小段 RNA，作為合成 DNA的引物（ Primer)，并由這一小段 RNA引物提供 3?OH， 經 DNA聚合酶催化鏈的延伸。 DNA聚合酶 :以 DNA為模板的 DNA合成酶 ● 以四種脫氧核苷酸三磷酸為底物 ● 反應需要有模板的指導 ● 反應需要有 3?OH存在 ● DNA鏈的合成方向為 5 ? ? 3 ? 性質 聚合酶 Ⅰ 聚合酶 Ⅱ 聚合酶 Ⅲ 339。 5 39。外切活性 + + + 539。 3 39。外切活性 + 539。 3 39。聚合活性 + 中 + 很低 + 很高 新生鏈合成 + 主要是對 DNA損傷的修復；以及在 DNA復制時切除 RNA引物并填補其留下的空隙。 修復紫外光引起的DNA損傷 DNA 復制的主要 聚合酶，還具有3’ 5‘ 外切酶的校對功能，提高DNA復制的保真性 原核生物中的 DNA聚合酶 (大腸桿菌） α β γ δ ε 定位 細胞核 細胞核 線粒體 細胞核 細胞核 3‘ 5’ 外切 + + + 酶活性 功能 引物 合成 修復 作用 線粒體 DNA 的復制 核 DNA 的復制 ？ 真核生物中的 DNA聚合酶 DNA連接酶（ 1967年發(fā)現(xiàn)）： 若雙鏈 DNA中一條鏈有切口，一端是 3’ OH， 另一端是 5‘ 磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。 但是它不能將兩條游離的 DNA單鏈連接起來 DNA連接酶 在 DNA復制、損傷修復、重組等過程中起重要作用 3‘ 5‘ 3‘ 5‘ OH P DNA 拓撲異構酶 (DNA Topisomerase)： 拓撲異構酶 ?： 使 DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，作用是松解負超螺旋。主要集中在活性轉錄區(qū)，同轉錄有關。 例：大腸桿菌中的 ε蛋白 拓撲異構酶 Π ： 該酶能暫時性地切斷和重新連接雙鏈 DNA，作用是 將 負超螺旋引入 DNA分子 。同復制有關。 例：大腸桿菌中的 DNA旋轉酶 上海生化所 1998年分子遺傳學試題： 拓撲異構酶 DNA 解螺旋酶 /解鏈酶（ DNA helicase) 通過水解 ATP獲得能量來解開雙鏈 DNA。 rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶 I、 II、 III。 rep蛋白沿 3 ’ ?5’ 移動，而解螺旋酶 I、 II、III沿 5 ’ ?3’ 移動。 單鏈結合蛋白 (SSBPsinglestrand binding protein)： 穩(wěn)定已被解開的 DNA單鏈，阻止復性和保護單鏈不被核酸酶降解。 （三） DNA的 復制過程（大腸桿菌為例） ? 雙鏈的解開 ? RNA引物的合成 ? DNA鏈的延伸 ? 切除 RNA引物，填補缺口，連接相鄰的 DNA片段 ? 復制是從 DNA分子上的特定部位開始的，復制起始點 (originof replication)常用 ori或 o表示，稱為 復制子或復制單元 (replicon)。 ? 在原核細胞中只有一個復制起始點，一個復制子。 ? 在真核生物中復制是從許多起始點同時開始的，即有多個復制子。 雙鏈的解開 雙鏈的解開 DNA的復制有特定的起始位點，叫做 復制原點。 ori(或 o） 、富含 A、 T的區(qū)段。 基本概念： 上海生化所 1998年分子遺傳學試題： 真核生物復制起始點的特征包括（ ）