分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件(編輯修改稿)
2024-09-01 03:22 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時(shí)也受菌齡、外界環(huán)境因子的影響。cAMP可以使感受態(tài)水平提高一萬倍，而Ca2+也可大大促進(jìn)轉(zhuǎn)化的作用。細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長期，新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。 制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，可加入占總體積15%的無菌甘油或70℃保存（有效期6個(gè)月）。 轉(zhuǎn)化的概念及原理 在基因克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。 受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法，如電擊法、CaCl2等化學(xué)試劑法處理后，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA分子通過的感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。然后在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化處理過的細(xì)菌，轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌可以在加入抗生素的培養(yǎng)基上形成菌落。三、 實(shí)驗(yàn)材料、設(shè)備及試劑實(shí)驗(yàn)材料 前次實(shí)驗(yàn)中所復(fù)壯的大腸桿菌單菌落液體培養(yǎng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)備及器具 低速冷凍離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、50 ml 離心管、10 ml刻度移液管、玻璃棒（三種器具均已經(jīng)過滅菌處理）。試劑及配置 M氯化鈣溶液（配制：，溶于90ml雙蒸水中，定容至100 ml, 轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，121 ℃滅菌20 min，保存。四、 實(shí)驗(yàn)步驟教師完成：、外觀呈圓形的單菌落，接種于實(shí)驗(yàn)一配好的LB液體培養(yǎng)基（試管裝）中，37 ℃ 200rpm振蕩培養(yǎng)14 h 。：501：100的比例進(jìn)行接種， ml 上述培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接在25 ml LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200rpm振蕩培養(yǎng)23 h （－）。學(xué)生操作：（按實(shí)驗(yàn)一確定的4人組）領(lǐng)取一支離心管（已滅菌，不要隨便打開），貼上自己的標(biāo)簽（鉛筆寫學(xué)號(hào)），按老師安排兩個(gè)小組同步在超凈工作臺(tái)上工作，每個(gè)小組用10 ml的移液管（已滅菌）吸取10 ml菌液放入自己的離心管中，兩個(gè)小組將離心管與蓋子一起置天平上進(jìn)行平衡，平衡后蓋上蓋子置于盛有冰塊的盆中冰浴10分鐘（時(shí)間可超過十分鐘）。待滿8管后送至離心機(jī)所在的實(shí)驗(yàn)室中，4000 rpm ，4 ℃,離心10 min 。，用5 ml的移液管（已滅菌）量取5 ml預(yù)冷的氯化鈣溶液加入離心管中，用手輕彈管壁將沉淀混勻,兩小組間用氯化鈣平衡，冰浴25 min（可延長） ,待有8管后4000rpm，4 ℃,離心10 min。，用取液槍吸取1ml冰浴預(yù)冷的氯化鈣溶液加入離心管中，輕彈管壁使細(xì)菌懸浮，制成感受態(tài)的細(xì)胞懸浮液， eppendolf管中，按順序擺放在離心管盒中，置－70 ℃ 保存。注意：實(shí)驗(yàn)從第三步開始，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程都必須無菌操作！五、思考題用試劑瓶盛裝的氯化鈣在滅菌時(shí)應(yīng)怎樣操作？答：可以高溫高壓滅菌，也可以過濾滅菌。高溫高壓滅菌注意蓋子不要蓋得太緊。步驟3和4中，對(duì)離心機(jī)應(yīng)當(dāng)做什么樣的預(yù)處理？答：由于整個(gè)實(shí)驗(yàn)都應(yīng)在低溫下進(jìn)行，因此需要對(duì)離心機(jī)進(jìn)行4 ℃的預(yù)冷。實(shí)驗(yàn)為什么必須全程在無菌條件下操作？答：防止雜菌和雜DNA的污染。否則會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。實(shí)驗(yàn)五 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化體篩選一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?了解轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義，學(xué)習(xí)將外源質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞并篩選轉(zhuǎn)化體的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理用CaCl2處理大腸桿菌細(xì)胞使其處于感受態(tài)后，通過熱激處理可將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)菌中。進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞的質(zhì)粒能夠自主復(fù)制并在宿主中實(shí)現(xiàn)其攜帶基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)使用的pUC19質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Amp )，理論上只有轉(zhuǎn)入了pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌才能在含Amp的培養(yǎng)基上生長。但抗性篩選只是初步的篩選，可能仍有部分未轉(zhuǎn)進(jìn)質(zhì)粒的細(xì)菌能在抗性培養(yǎng)基上生存（假陽性），因此尚需提取質(zhì)粒酶切、電泳作進(jìn)一步的鑒定。三、試劑與儀器設(shè)備：1．LB培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基：蛋白胨(typtone) % （1 g/100 ml）酵母提取物(Yeast extraction) % （）氯化鈉 % （1 g/100 ml）PH 固體培養(yǎng)基：100 含氨芐青霉素（Amp）50mg/l的固體LB培養(yǎng)基 %瓊脂粉，高壓滅菌消毒，待泠卻至不燙手時(shí)加入Amp鋪培養(yǎng)皿。2．。3．pUC19質(zhì)粒 配制成約50ng/μl。4．感受態(tài)DH5α大腸桿菌 5．恒溫水浴箱6．超凈工作臺(tái)7．恒溫?fù)u床8．生化培養(yǎng)箱9．無菌離心管10．無菌tips 11．玻璃涂布器12．75%乙醇13．標(biāo)記筆四、實(shí)驗(yàn)步驟教師操作：從70℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上學(xué)生操作（四人一組）：每組從冰上取2管感受態(tài)細(xì)胞懸液（每管200μl），其中一管加入50ng/μl的pUC19質(zhì)粒DNA溶液1ul，貼上各自組的標(biāo)簽，另一個(gè)加入1 ul無菌水后，也貼上標(biāo)簽，兩個(gè)離心管同時(shí)在冰上放置30分鐘。將兩個(gè)離心管同時(shí)轉(zhuǎn)入42℃水浴中熱激90秒后，迅速置于冰上12分鐘。在超凈工作臺(tái)上分別向兩管中加入800 ul LB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，37℃恒溫?fù)u床緩慢振蕩培養(yǎng)45分鐘。 以5000rpm離心濃縮菌液，在超凈工作臺(tái)上分別取上述兩個(gè)離心管中的菌液100μl ，各自涂布于一個(gè)含Amp的篩選平板上，用標(biāo)記筆分別標(biāo)記為轉(zhuǎn)化組、對(duì)照組，待菌液干后，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1624小時(shí)（第二天下午3：00后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果）。 轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)本應(yīng)設(shè)置兩個(gè)對(duì)照： 對(duì)照組1 用來判斷不加入質(zhì)粒的大腸桿菌在抗性培養(yǎng)基上生長的狀況，排除假陽性對(duì)照組2 用來判斷制備成感受態(tài)后的大腸桿菌在普通培養(yǎng)基上的生長狀況 五、計(jì)算轉(zhuǎn)化率 轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)（CFU）可計(jì)算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下：轉(zhuǎn)化子總數(shù)＝菌落數(shù)涂板前離心管中菌液體積／涂板時(shí)所用菌液體積轉(zhuǎn)化頻率 ＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／質(zhì)粒DNA加入量(mg) 轉(zhuǎn)化效率＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／感受態(tài)細(xì)胞總數(shù) 六、思考題“E. coli DH5α菌株： Rˉ，Mˉ，Ampˉ”提供了哪些關(guān)于該菌株的信息？步驟3中，為何在大腸桿菌轉(zhuǎn)化完成后需要在不含Amp的LB培養(yǎng)基中緩慢振蕩培養(yǎng)45 min后方能涂布于抗性篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選？ 設(shè)對(duì)照2分別有什么目的？在上述實(shí)驗(yàn)中，我們實(shí)際做了哪個(gè)對(duì)照？實(shí)驗(yàn)六 質(zhì)粒DNA的限制性酶切、PCR擴(kuò)增與檢測一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
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