【正文】 堿法分離質粒DNA時，染色體DNA之所以可以被除去，是因為：C，而不能釋放七 思考題？答：葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪切力作用而降解。溶液終濃度為: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L飽和酚、氯仿、TE緩沖液六 實驗步驟1. eppendorf管中，5000 rpm 5 min收集菌體；2. 棄上清,將管倒置于吸水紙上盡量使液體流盡；　3.　菌體沉淀重懸浮于200μl溶液Ⅰ中；4. 按試劑配方配制溶液Ⅱ，加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 蓋緊管口，快速溫和上下顛倒eppendorf管數(shù)次以混勻溶液(千萬不要振蕩，動作輕柔)；5. 立即加入200μl預冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口并溫和顛倒離心管數(shù)次，混勻溶液，置冰浴中10分鐘；6. 12000 rpm離心10分鐘；7. 加入等體積的酚/氯仿(1:1)，顛倒混勻， 12000 rpm 10分鐘；8. 小心吸取上清夜移入干凈eppendorf管中，加入2倍體積的無水乙醇，振蕩混勻后置于20℃冰箱中20分鐘；9. 12000 rpm離心10分鐘；10. 棄上清, 將管倒置于吸水紙上使所有液體流出，加入200μl預冷的70％乙醇洗滌沉淀。二 實驗原理本實驗利用NaOH破壞菌體細胞使核酸物質從細胞中釋放出來，因此稱為堿裂解法抽提。(9) 取其中的一瓶直接倒培養(yǎng)皿，每皿倒入的量以剛好能在培養(yǎng)皿底鋪展成薄薄的一層即可。(4) 將100ml溶液分裝入兩個三角瓶，每瓶為50ml。(3) pH試紙檢測pH值，并用1 N NaOH或1 N 。(8) 取出三角瓶后，在酒精燈火焰旁進行下述操作。四、思考題(1) 在說明本實驗所用的菌種時用到這樣的符號：“R，M，Amp”，這告訴我們關于該菌種的什么信息？(2) 在步驟7中，為何須待連續(xù)的白色水蒸氣從排氣閥排出時才能關閉排氣閥？當滅菌完畢，為何又須待高壓鍋指示器指示壓力降為0時才能打開高壓鍋，而且操作次序必須是先打開排氣閥然后才能打開高壓鍋蓋？(3) 在步驟12中，為何需將涂有菌的培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中進行菌的培養(yǎng)？為什么不是正放呢？(4) 你預計該實驗結果是什么，即兩種培養(yǎng)基上菌的生長情況如何？實驗二 堿裂解法小量提取質粒DNA一 實驗目的了解少量質粒制備方法與原理，掌握堿法小量提取質粒DNA的操作步驟。溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 ， H2O ，定容至100ml, 并高壓滅菌。4. 質粒DNA分子小，所以沒有變性，染色體變性后不能復性。5. 最后DNA沉淀可以溶解在雙蒸水（ddH2O）中，但最好溶解于TE緩沖液中，為何？答：由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用TrisHCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。三、試劑與儀器設備：1. 質粒DNA2. 瓊脂糖3. 6載樣buffer % 二甲苯青FF，% 溴酚藍，30% 甘油4．50TAE 電泳Buffer Tris， 冰醋酸，10ml mol/L EDTA()，加水至50ml。倒膠時的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現(xiàn)氣泡。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2～1cm時,停止電泳。根據(jù)DNA marker分析質粒DNA溶液大致的濃度。電泳緩沖液的作用：一是維持合適的pH；二是使溶液具有一定的導電性，以利于DNA分子的遷移。細胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對數(shù)生長期，新鮮幼嫩的細胞是制備感受態(tài)細胞和進行成功轉化的關鍵。試劑及配置 M氯化鈣溶液（配制：，溶于90ml雙蒸水中，定容至100 ml, 轉移至試劑瓶中，121 ℃滅菌20 min，保存。高溫高壓滅菌注意蓋子不要蓋得太緊。但抗性篩選只是初步的篩選，可能仍有部分未轉進質粒的細菌能在抗性培養(yǎng)基上生存（假陽性），因此尚需提取質粒酶切、電泳作進一步的鑒定。 　　轉化實驗本應設置兩個對照： 　　對照組1 用來判斷不加入質粒的大腸桿菌在抗性培養(yǎng)基上生長的狀況，排除假陽性對照組2 用來判斷制備成感受態(tài)后的大腸桿菌在普通培養(yǎng)基上的生長狀況　五、計算轉化率 　　轉化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)（CFU）可計算出轉化子總數(shù)和轉化頻率，公式如下：轉化子總數(shù)＝菌落數(shù)涂板前離心管中菌液體積／涂板時所用菌液體積轉化頻率 ＝轉化子總數(shù)／質粒DNA加入量(mg) 　轉化效率＝轉化子總數(shù)／感受態(tài)細胞總數(shù) 　六、思考題“E. coli DH5α菌株： Rˉ，Mˉ，Ampˉ”提供了哪些關于該菌株的信息？步驟3中，為何在大腸桿菌轉化完成后需要在不含Amp的LB培養(yǎng)基中緩慢振蕩培養(yǎng)45 min后方能涂布于抗性篩選培養(yǎng)基上進行抗性篩選？ 設對照2分別有什么目的？在上述實驗中，我們實際做了哪個對照？實驗六 質粒DNA的限制性酶切、PCR擴增與檢測一、實驗目的 掌握PCR、限制性內(nèi)切酶酶切的技術原理和操作要點，增進對理論知識的理解。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中,有的在對稱軸處切割產(chǎn)生平末端的DNA片段，有的切割位點在對稱軸一側產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端。對質粒DNA酶切反應而言, 限制性內(nèi)切酶用量可按標準體系1μg DNA加1單位酶,消化12小時。瓊脂糖凝膠電泳 參見實驗三。6．dNTP ：分別取等體積的10mol/L的dATP，dGTP，dTTP，dCTP四種混合即成7．Taq DNA聚合酶： U/μl。 （三）瓊脂糖凝膠電泳 　　步驟略，請自行設計實驗步驟。L溶液I，在漩渦混合器上振蕩混勻至沉淀徹底分散。L)抽提，12000rpm離心5min；取上清再用等體積的氯仿/異戊醇溶液抽提一次，12000rpm離心5min。二、實驗原理由于植物細胞有細胞壁及其細胞內(nèi)高含量的多糖類物質，因此用于真核細胞基因組DNA提取的一般方法用在植物細胞上并不十分有效。(6) 將上清轉移至另一個15 ml離心管中；(7) 加入至少2/3體積的異丙醇， M（每10 ml上清中加入7 ml異丙醇，580 ul 3 M NaAc）,輕輕旋轉混勻，20℃沉淀12 hr；(8) 12000 rpm離心10 min，除去殘余液體；(9) 用預冷的70%乙醇洗滌2次，低速離心（6000 rpm，10 min）除去殘余液體；(10) 用預冷的無水乙醇浸泡DNA沉淀5 min，12000 rpm離心510 min，除去上清， 37℃干燥。但不能區(qū)分DNA與RNA的含量。