分子生物學(xué)實驗課件-資料下載頁
2025-08-05 03:22本頁面
【正文】 穩(wěn)定的染色體DNA。三、實驗材料普通細(xì)菌四、實驗設(shè)備微量取液器(100μl,1000μl)， 臺式高速離心機(jī)，制冰機(jī)五、試劑溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L ()， 10mmol/L EDTA ()。 溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高壓滅菌15分鐘,儲存于4℃冰箱?！ ? mol/L NaAc（）、 Tris飽和酚/氯仿（1:1）、TE緩沖液、RNase六、實驗步驟1. 取菌液1mL，12000rpm離心1min，棄上清。2. 加入100 181。L溶液I，在漩渦混合器上振蕩混勻至沉淀徹底分散。3. 再加入650 181。L 溶液I，振蕩混勻。4. 181。L的100mg/mL溶菌酶至終濃度為1mg/mL，混勻，37℃溫浴30分鐘。5. 181。L蛋白酶K（10mg/mL），混勻，55℃ h，中間輕緩顛倒離心管數(shù)次。6. 溫浴結(jié)束后向溶液中加入用等體積的酚/氯仿/異戊醇溶液(750 181。L)抽提，12000rpm離心5min；取上清再用等體積的氯仿/異戊醇溶液抽提一次，12000rpm離心5min。7. 取上清（約500 181。L ）至新的離心管中，向上清中加入1/10體積（約50 181。L ）的3 mol/L醋酸鈉（）混勻，再加入2倍體積的無水乙醇，混勻，20℃靜止30分鐘沉淀DNA，取出， 4℃ 12000rpm離心10min，棄上清（注意別將沉淀倒掉）。8. 用1mL 70%酒精洗滌，棄上清，沉淀放入37℃烘箱中數(shù)分鐘除去酒精。9. 用40 181。L TE溶解，加入2uL RNaseA，37℃溫浴20min，20 ℃保存。實驗八 植物基因組DNA的提取一、實驗?zāi)康模?學(xué)習(xí)植物DNA分離的原理，掌握植物基因組DNA提取的方法。二、實驗原理由于植物細(xì)胞有細(xì)胞壁及其細(xì)胞內(nèi)高含量的多糖類物質(zhì)，因此用于真核細(xì)胞基因組DNA提取的一般方法用在植物細(xì)胞上并不十分有效。常用的方法有CTAB法和SDS法。這里我們采用CTAB法進(jìn)行植物基因組DNA的提取。CTAB法是由Murray 和Thompson（1980）修改而成的簡便方法。本方法通過液氮研磨粉碎植物組織、裂解液（CTAB溶液）裂解細(xì)胞、有機(jī)溶劑抽提，使進(jìn)入水相的核酸與蛋白成分分開，在RNA酶作用下，降解RNA，得純度較高的DNA樣品。CTAB是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（ mol/L NaCl）是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度（ mol/L NaCl）時，從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB核酸的復(fù)合物與蛋白、多糖類物質(zhì)分開。最后通過乙醇或異丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或異丙醇而除去。三、試劑與儀器設(shè)備：CTAB Buffer (裂解Buffer) CTAB 2％（w/v） TrisHCl（pH ） 100 mM EDTA（pH ） 20 mM NaCl M氯仿/異戊醇（24:1）3M NaAcRNaseA 10mg/ml 異丙醇 β巰基乙醇 氯仿/異戊醇（25/24/1） 70%乙醇 恒溫水浴鍋 ，臺式高速離心機(jī)液氮，液氮罐1移液槍、滅菌槍頭、離心管四、實驗步驟(1) 將CTAB Buffer放于65℃水浴中預(yù)熱；(2) ，用鑷子夾住離心管浸入液氮中充分速凍(3) 從液氮中取出用研棒迅速研磨成粉末；(4) 立即加入700ul預(yù)熱的CTAB Buffer；同時加入巰基乙醇至終濃度10ul，在65℃水浴中輕輕搖動1015 min；(5) 加入等體積的氯仿：異戊醇（24：1，v/v），室溫下顛倒離心管數(shù)次保證樣品與溶液充分作用，1520℃ 12000 rpm離心10 min。(6) 將上清轉(zhuǎn)移至另一個15 ml離心管中；(7) 加入至少2/3體積的異丙醇， M（每10 ml上清中加入7 ml異丙醇，580 ul 3 M NaAc）,輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，20℃沉淀12 hr；(8) 12000 rpm離心10 min，除去殘余液體；(9) 用預(yù)冷的70%乙醇洗滌2次，低速離心（6000 rpm，10 min）除去殘余液體；(10) 用預(yù)冷的無水乙醇浸泡DNA沉淀5 min，12000 rpm離心510 min，除去上清， 37℃干燥。(11) 20ul ddH2O或TE buffer溶解，℃數(shù)小時。(12) 4℃短時間保存，或20℃長時間保存。\實驗九 紫外分光光度法測定核酸濃度一、實驗?zāi)康模?了解紫外線（UV）吸收法測定核酸濃度的原理熟悉分光光度計的操作；計算DNA含量，學(xué)習(xí)核酸濃度的定量技術(shù)。二、實驗原理核酸、核苷酸及其衍生物都具有共軛雙鍵系統(tǒng)，能吸收紫外光，在240~290nm的紫外波段有強(qiáng)烈的吸收峰，DNA鈉鹽的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值，其吸光率（absorbance）以A260表示。A260是核酸的重要性質(zhì)，在核酸的研究中很有用處。RNA鈉鹽的吸收曲線與DNA無明顯區(qū)別。不同核苷酸有不同的吸收特性，所以可以用紫外分光光度計通過測定核酸溶液對光的吸收確定核酸的濃度和純度。但不能區(qū)分DNA與RNA的含量。純DNA的A260/。樣品中如果混雜有蛋白質(zhì)或苯酚，A260/A280比值會明顯降低。通常在A260nm波長下，以1OD值相當(dāng)于50μg／mL雙螺旋DNA，或40μg／mL單鏈DNA（或RNA），或20μg／mL寡核苷酸加以計算。此法操作簡便，迅速。但若樣品內(nèi)混雜有大量的核苷酸或蛋白質(zhì)等能吸收紫外光的物質(zhì)，則測定誤差較大，故為了測定準(zhǔn)確應(yīng)設(shè)法預(yù)先除去。三、試劑與儀器設(shè)備：DNA樣品；滅菌雙蒸水（ddH2O）紫外分光光度計；狹縫石英比色杯；微量移液器、加樣槍頭四、實驗步驟接通紫外分光光度計電源，使儀器處于紫外測定狀態(tài)下預(yù)熱20min；調(diào)波長至所需，吸取1ml ddH2O至石英杯中調(diào)節(jié)分光光度計零點；倒掉ddH2O，在石英杯中加入已稀釋好的DNA樣品溶液，進(jìn)行相應(yīng)波長下的光吸收值的測定；測定完畢，將石英杯中的樣品溶液回收回指定的容器中；用洗瓶洗滌石英杯，再重復(fù)24步驟進(jìn)行第二個波長下的光吸收值的測定；通過測定的260nm和280nm的OD值，計算A260/A280比率。比率；計算DNA濃度五、實驗結(jié)果分析所測樣品純度，可能含有的雜質(zhì)，樣品DNA大致的濃度。
公司管理相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1