分子生物學(xué)試題-資料下載頁
2025-08-04 14:16本頁面
【正文】 。G+C含量一般占45％ 55％。3’端和5’端引物具有相似的Tm值,Tm值計(jì)算公式：Tm＝4(G+C)+ 2(A+T)引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。引物的連續(xù)互補(bǔ)序列，一般不超過3bp。兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊。引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不超過70％，引物3’末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。引物3’端堿基是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板DNA配對(duì)。引物3’端最佳堿基選擇是G和C，形成的堿基配對(duì)比較穩(wěn)定。引物與模板結(jié)合時(shí)，引物的5’端最多可以游離十幾個(gè)堿基而不影響PCR反應(yīng)的進(jìn)行。引物的5’端可以修飾，如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列包括起始密碼子、終止密碼子等（十八）、PCR的反應(yīng)條件？答：PCR反應(yīng)的緩沖液： ? TrisHCl緩沖液? KCl 促進(jìn)引物的退火，濃度太高時(shí)會(huì)抑制Taq DNA聚合酶活性。? 加入BSA或明膠有利于保護(hù)TaqDNA聚合酶活性。? 必要時(shí)加入適量二甲基亞砜(DMSO)或甲酰胺利于破壞模板二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高PCR反應(yīng)特異性。鎂離子濃度 mmol/L，Taq DNA聚合酶活性需要Mg 2+。Mg 2+濃度過低，會(huì)顯著降低酶活性。Mg 2+濃度過高又使酶催化非特異性擴(kuò)增增強(qiáng)。Mg 2+濃度還會(huì)影響引物的退火、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，從而影響擴(kuò)增片段的產(chǎn)率。 底物濃度 工作濃度20200umol/L， dNTPs濃度過高可加快反應(yīng)速度，也增加堿基的錯(cuò)配率和實(shí)驗(yàn)成本。降低濃度會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速度下降，可提高反應(yīng)的特異性。在PCR反應(yīng)中，4種dNTP必須以等摩爾濃度配制，以減少PCR反應(yīng)的錯(cuò)配誤差并提高使用效率。Taq DNA聚合酶 7580℃時(shí)具有最高的聚合酶活性，150個(gè)核苷酸/秒；具有良好的熱穩(wěn)定性，95℃仍有活性。引物 。引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配或非特異性擴(kuò)增、生成引物二聚體，使目的DNA片段產(chǎn)率下降。退火溫度與引物Tm值有關(guān)，引物Tm值在5580 ℃ 范圍較為理想。反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)（十九）、影響大腸桿菌系統(tǒng)外源基因表達(dá)的因素？答：?jiǎn)?dòng)子的強(qiáng)弱；基因的劑量；影響RNA轉(zhuǎn)錄和翻譯效率的因素：SD序列、mRNA；外源基因密碼子的選擇；表達(dá)產(chǎn)物的大??；表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。（二十）、大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)外源基因必須具備的條件？答：要求外源基因的編碼區(qū)不能含有內(nèi)含子；表達(dá)的外源片段要位于大腸桿菌啟動(dòng)子的下游，并形成正確的閱讀框架；轉(zhuǎn)錄出的mRNA必須有與大腸桿菌16S rRNA3，末端相匹配的SD序列，才能被有效的翻譯成蛋白質(zhì)。蛋白產(chǎn)物必須穩(wěn)定，不易被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶快速降解，且對(duì)宿主無害。（二十一）、真核細(xì)胞表達(dá)外源基因的條件？答：首先必須具備哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的功能元件。要求哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體帶有能在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件；注意選擇轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞，不同類型的細(xì)胞具有不同的特性；注意選擇適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記。（二十二）、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的概念、原理及應(yīng)用？答：概念：是指用人工方法將外源基因?qū)牖蛘系交蚪M內(nèi)，并能穩(wěn)定傳代的一類動(dòng)物。它的特點(diǎn)是“分子及細(xì)胞水平操作，組織及動(dòng)物整體水平表達(dá)”?；驹恚簩⒛康幕蚧蚧蚪M片段用顯微注射等方法注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞中，使目的基因整合到基因組中，然后將此受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞再植入受體動(dòng)物的輸卵管或子宮中，使其發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，人們可以通過分析轉(zhuǎn)基因和動(dòng)物表型的關(guān)系，揭示外源基因的功能；也可以通過轉(zhuǎn)入外源基因培育優(yōu)良的動(dòng)物品種。應(yīng)用：建立用于研究外源基因表達(dá)調(diào)控體系；建立醫(yī)學(xué)中常用的疾病模型；培育動(dòng)物新品種；藥理學(xué)和藥用蛋白的生產(chǎn)研究。（二十三）、基因敲除的基本程序？答：通過DNA同源重組，使得胚胎干細(xì)胞特定的內(nèi)源基因被破壞而造成功能喪失，然后通過胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)得到該基因喪失的小鼠模型的過程稱為基因敲除。 打靶載體的構(gòu)建：同源序列要足夠長(zhǎng)，要含有篩選用的標(biāo)志基因。 胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng) 打靶載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞 同源重組胚胎干細(xì)胞的篩選 基因敲除胚胎干細(xì)胞注射入胚泡 胚泡植入假孕小鼠的子宮中 雜交育種獲得純合的基因敲除動(dòng)物（二十四）、DNA芯片的原理？答：DNA芯片技術(shù)就是一種大規(guī)模的集成的固相核酸分子雜交，以大量已知堿基序列的寡核苷酸片段為探針，檢測(cè)樣品中哪些核酸序列與其互補(bǔ)，然后通過定性定量分析得出待測(cè)樣品的基因序列及表達(dá)的信息。其方法包括芯片的制備、樣品的準(zhǔn)備、分子雜交和檢測(cè)分子。（二十五）、誘變劑的作用機(jī)制？答：堿基的類似物誘發(fā)突變改變DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)結(jié)合到DNA分子上誘發(fā)移碼突變紫外線及其他射線引起的DNA分子的變化（二十六）、突變類型及其遺傳效應(yīng)？答：突變類型：① 點(diǎn)突變：DNA大分子上一個(gè)堿基的變異。分為轉(zhuǎn)換和顛換。② 缺失：一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。③ 插入：一個(gè)原來沒有的堿基或一段原來沒有的核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。④ 倒位：DNA鏈內(nèi)重組，使其中一段方向倒置。突變的遺傳效應(yīng)：①遺傳密碼的改變：錯(cuò)義突變、無義突變、同義突變、移碼突變② 對(duì)mRNA剪接的影響：一是使原來的剪接位點(diǎn)消失；二是產(chǎn)生新的剪接位點(diǎn)。③ 蛋白質(zhì)肽鏈中的片段缺失：（二十七）、基因治療的策略？答：基因置換或稱基因矯正：特定的目的基因?qū)胩囟ǖ募?xì)胞，通過定位重組，讓導(dǎo)入的正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原有的缺陷基因，不涉及基因組的任何改變。
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