揚(yáng)州大學(xué)現(xiàn)代分子生物學(xué)5-分子生物學(xué)研究方法-資料下載頁
2025-01-04 05:44本頁面
【正文】 1，擴(kuò)增子接上接頭 2，與驅(qū)逐子雜交，PCR擴(kuò)增；去除接頭2，加上接頭 3，再與 driver雜交，再擴(kuò)增，篩選出目的片段、克隆、測序。 酵母雙雜交體系 （ Yeast towhybrid system） ?基于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識，高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。 ?細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。 ?反式轉(zhuǎn)錄激活因子 GAL4： DNA結(jié)合功能域 (DNA binding domain,DNABD) 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（ activation domain， DNAAD） ?被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時，才能重新呈現(xiàn)完整的 GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列（ upstream activating sequence, UAS）的下游啟動子，使下游基因得到轉(zhuǎn)錄。 基因克隆技術(shù)簡介 基因克隆技術(shù)簡介 ? 主要實驗過程： a. 選擇缺失 GAL4編碼基因的酵母寄主菌株 b. 研究的獵物 (或稱靶蛋白 )蛋白的基因與編碼 AD的序列結(jié)合 (bait)蛋白的基因與編碼 BD的序列結(jié)合 ,形成兩段融合基因 d. 將共轉(zhuǎn)化的酵母菌株涂布于選擇培養(yǎng)基上，篩選表達(dá)相互作用的雜種蛋白（激活報告基因轉(zhuǎn)錄）的陽性菌落。 基因克隆技術(shù)簡介 酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用： ? 發(fā)現(xiàn)新蛋白和蛋白的新功能 ? 研究抗原和抗體的作用（細(xì)胞內(nèi)） ? 篩選藥物的作用位點 ? 建立基因組蛋白連鎖圖 基因克隆技術(shù)簡介 ? 1986年提出，根據(jù)目的基因在染色體上的位置進(jìn)行的，無需預(yù)先知道基因的 DNA順序，也無需預(yù)先知道其表達(dá)產(chǎn)物的有關(guān)信息，但必須建立遺傳分離群體 ? 主要用于與遺傳病相關(guān)基因等致病基因的克隆 基因的圖位克隆法 （ Mapbased cloning） 基因克隆技術(shù)簡介 ?將目的基因定位到某個染色體的特定位點，并在其兩側(cè)確定緊密連鎖的 RFLP或 RAPD分子標(biāo)記 ?利用與目的基因最緊密連鎖的一對分子標(biāo)記作探針，通過染色體步移技術(shù)將位于這兩個標(biāo)記之間的基因片段克隆并分離出來 ?鑒定目的基因 步驟 : 基因克隆技術(shù)簡介 ? 染色體步移： 利用已知的基因或分子標(biāo)記來篩選大片段的DNA文庫獲得陽性克隆，如此得到的陽性克隆是“一步克隆”，利用獲得的克隆作探針對文庫進(jìn)行第二次雜交，得到與探針具有重復(fù)序列的陽性克隆稱為“二次克隆”，如此反復(fù)即可取到需要要得克隆，獲得目的基因。 基因克隆技術(shù)簡介 基因表達(dá)研究技術(shù) 基因表達(dá)系列分析技術(shù) RNA選擇性剪切機(jī)制 原位雜交技術(shù) 定點突變技術(shù) RNAi技術(shù) P171180 ? 蛋白質(zhì)組學(xué) ：蛋白質(zhì)和基因組研究相結(jié)合，研究某一物種、個體、器官、組織、或細(xì)胞在特定條件、特定時間所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)圖譜。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù) ? （一）、雙向電泳技術(shù) ? （二）、質(zhì)譜技術(shù) ? （三）、蛋白質(zhì)免疫印跡實驗 ? （四）、凝膠阻滯實驗（ EMSA） ? （五）、噬菌體展示技術(shù) ? （六）、免疫共沉淀技術(shù) ? （七）、蛋白質(zhì)磷酸化分析 P183— 191 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH
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