分子生物學(xué)研究方法(2)-資料下載頁
2025-01-13 07:59本頁面
【正文】 imary Ab Step 3. Color Development 四、 Western印跡雜交 五、原位雜交（教材 P175） 組織原位雜交簡稱原位雜交（ in situ hybridization）， 是在細(xì)胞保持基本形態(tài)的情況下將探針注入細(xì)胞內(nèi)與 RNA或 DNA雜交，雜交反應(yīng)在載物片上的細(xì)胞內(nèi)進行。 基本步驟是通過適當(dāng)處理使細(xì)胞滲透性增加，探針進入細(xì)胞內(nèi)與 DNA或 RNA雜交、沖洗等。用放射自顯影或免疫酶法或熒光顯示雜交結(jié)果。 Localization of DNA Localization of RNA 六、基因芯片 基因芯片（ Gene Chip）通常指 DNA芯片，其基本原理是將指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強弱進而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。 (教材 ) （一）基因芯片的種類 光引導(dǎo)原位合成技術(shù)生產(chǎn)寡聚核苷酸微陣列 微電子芯片 微量點樣技術(shù) 其他技術(shù) （二）應(yīng)用領(lǐng)域 科研領(lǐng)域 生物制藥領(lǐng)域 醫(yī)學(xué)診斷 七、酵母雜交技術(shù) （一）酵母雙雜交技術(shù) 基本原理 改進和發(fā)展 (教材 ) （二）酵母單雜交技術(shù) 酵母單雜交技術(shù)的原理 酵母單雜交技術(shù)的應(yīng)用 第五節(jié)、基因擴增與定點突變技術(shù) 一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR） (教材 ) （一） PCR反應(yīng)中的主要成份 DNA模板 dNTPs 引物 Mg++ 反應(yīng)緩沖液 DNA聚合酶 引物設(shè)計和選擇目的 DNA序列區(qū)域時可遵循下列原則 ： (1) 長度約為 1630bp。 (2) G+C含量通常為 40%60%。 (3) 四種堿基應(yīng)隨機分布 。 (4) 3‘ 端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位 核苷酸對應(yīng) , 以減少由于密碼子擺動產(chǎn)生的不配對 。 (5) 在引物內(nèi) , 尤其在 339。端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu) 。 (6) 兩引物之間尤其在 339。端不能互補 。 (7) 539。端可增加酶切位點 。 (8) 引物不與模板結(jié)合位點以外的序列互補 。 (9) 簡并引物應(yīng)選用簡并程度低的密碼子。 Target Sequence （ 二） PCR反應(yīng)參數(shù) 變性 退火 延伸 循環(huán)次數(shù) 片段擴增倍數(shù) No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon （三） PCR產(chǎn)物的克隆 1. 平末端連接：由于 Taq DNA聚合酶往往在 PCR產(chǎn)物3‘ 端加上多余的非模板依賴堿基，在用平末端連接克隆 PCR產(chǎn)物前，可用 Klenow片段或 T4 DNA聚合酶處理補平末端。 2. 在 PCR產(chǎn)物尾部加 dT或 ddT： Taq DNA聚合酶會在3‘ 端加上多余的非模板依賴堿基，而且對 A優(yōu)先聚合，所以 PCR產(chǎn)物末端的多余堿基大部分都是 A。 3. 粘性末端連接：利用引物中附加在 539。端的限制酶位點，直接將 PCR產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈詈螽a(chǎn)生粘性末端，與載體連接，產(chǎn)生重組 DNA。 二、 RTPCR 反轉(zhuǎn)錄 PCR 利用 mRNA作模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成 cDNA。 以 cDNA為模板，進行 PCR擴增反應(yīng)。 AAA(A)n TTTTTT 反轉(zhuǎn)錄酶 AAA(A)n TTTTTT S1核酸酶 堿 TTTTTT Klenow+dNTPs+緩沖液 TTTTTT 雙鏈 cDNA 三、定點突變（ sitedirected mutagenesis） 盒式誘變 (cassette mutagenesis)，包括盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。 (教材 ) 寡核苷酸引物誘變 PCRG與 PCR誘變
高考資料相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1