分子生物學(xué)研究方法(2)-資料下載頁(yè)
2025-01-13 07:59本頁(yè)面
【正文】 imary Ab Step 3. Color Development 四、 Western印跡雜交 五、原位雜交（教材 P175） 組織原位雜交簡(jiǎn)稱原位雜交（ in situ hybridization）， 是在細(xì)胞保持基本形態(tài)的情況下將探針注入細(xì)胞內(nèi)與 RNA或 DNA雜交，雜交反應(yīng)在載物片上的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。 基本步驟是通過(guò)適當(dāng)處理使細(xì)胞滲透性增加，探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與 DNA或 RNA雜交、沖洗等。用放射自顯影或免疫酶法或熒光顯示雜交結(jié)果。 Localization of DNA Localization of RNA 六、基因芯片 基因芯片（ Gene Chip）通常指 DNA芯片，其基本原理是將指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。 (教材 ) （一）基因芯片的種類 光引導(dǎo)原位合成技術(shù)生產(chǎn)寡聚核苷酸微陣列 微電子芯片 微量點(diǎn)樣技術(shù) 其他技術(shù) （二）應(yīng)用領(lǐng)域 科研領(lǐng)域 生物制藥領(lǐng)域 醫(yī)學(xué)診斷 七、酵母雜交技術(shù) （一）酵母雙雜交技術(shù) 基本原理 改進(jìn)和發(fā)展 (教材 ) （二）酵母單雜交技術(shù) 酵母單雜交技術(shù)的原理 酵母單雜交技術(shù)的應(yīng)用 第五節(jié)、基因擴(kuò)增與定點(diǎn)突變技術(shù) 一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR） (教材 ) （一） PCR反應(yīng)中的主要成份 DNA模板 dNTPs 引物 Mg++ 反應(yīng)緩沖液 DNA聚合酶 引物設(shè)計(jì)和選擇目的 DNA序列區(qū)域時(shí)可遵循下列原則 ： (1) 長(zhǎng)度約為 1630bp。 (2) G+C含量通常為 40%60%。 (3) 四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布 。 (4) 3‘ 端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位 核苷酸對(duì)應(yīng) , 以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對(duì) 。 (5) 在引物內(nèi) , 尤其在 339。端應(yīng)不存在二級(jí)結(jié)構(gòu) 。 (6) 兩引物之間尤其在 339。端不能互補(bǔ) 。 (7) 539。端可增加酶切位點(diǎn) 。 (8) 引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ) 。 (9) 簡(jiǎn)并引物應(yīng)選用簡(jiǎn)并程度低的密碼子。 Target Sequence （ 二） PCR反應(yīng)參數(shù) 變性 退火 延伸 循環(huán)次數(shù) 片段擴(kuò)增倍數(shù) No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon （三） PCR產(chǎn)物的克隆 1. 平末端連接：由于 Taq DNA聚合酶往往在 PCR產(chǎn)物3‘ 端加上多余的非模板依賴堿基，在用平末端連接克隆 PCR產(chǎn)物前，可用 Klenow片段或 T4 DNA聚合酶處理補(bǔ)平末端。 2. 在 PCR產(chǎn)物尾部加 dT或 ddT： Taq DNA聚合酶會(huì)在3‘ 端加上多余的非模板依賴堿基，而且對(duì) A優(yōu)先聚合，所以 PCR產(chǎn)物末端的多余堿基大部分都是 A。 3. 粘性末端連接：利用引物中附加在 539。端的限制酶位點(diǎn)，直接將 PCR產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈詈螽a(chǎn)生粘性末端，與載體連接，產(chǎn)生重組 DNA。 二、 RTPCR 反轉(zhuǎn)錄 PCR 利用 mRNA作模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成 cDNA。 以 cDNA為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng)。 AAA(A)n TTTTTT 反轉(zhuǎn)錄酶 AAA(A)n TTTTTT S1核酸酶 堿 TTTTTT Klenow+dNTPs+緩沖液 TTTTTT 雙鏈 cDNA 三、定點(diǎn)突變（ sitedirected mutagenesis） 盒式誘變 (cassette mutagenesis)，包括盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。 (教材 ) 寡核苷酸引物誘變 PCRG與 PCR誘變
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