分子生物學(xué)研究技術(shù)(理論)-資料下載頁
2025-01-01 03:23本頁面
【正文】 原理 PCR的反應(yīng)體系和方法 1989年美國《 Science》雜志列 PCR 為十余項重大科學(xué)發(fā)明之首 ,比喻 1989年為 PCR爆炸年 ,Mullis榮獲 1993年度諾貝爾化學(xué)獎。 PCR技術(shù)簡史 ? DNA的復(fù)制 ? 核酸體外擴增的設(shè)想 ? 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 ? 1971年 ， Khorana提出：經(jīng)過 DNA變性 ， 與合適引物雜交 ， 用 DNA聚合酶延伸引物 ， 并不斷重復(fù)該過程便可克隆 tRNA基因 。 ? 但由于測序和引物合成的困難 ， 以及 70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能 ， 所以 ， Khorana的設(shè)想被人們遺忘了 …… PCR技術(shù)簡史 ? DNA的復(fù)制 ? 核酸體外擴增的設(shè)想 ? 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 ? 1985年 ， 美國 PECetus公司的 Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng) （ PCR） ? 基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的 DNA復(fù)制 ? 最初采用 Ecoli DNA聚合酶進行 PCR， 由于該酶不耐熱 ， 使這一過程耗時 ， 費力 ， 且易出錯 ? 耐熱 DNA聚合酶的應(yīng)用使得 PCR能高效率的進行 ，隨后 PECetus公司推出了第一臺 PCR自動化熱循環(huán)儀 ? 1993年 ， Mullis等因此項技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎 1 2 3 4 5 22 55 72 94 時間（ min） 溫度 （ ℃ ） PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 適溫延伸 3 高溫變性 1 低溫退火 2 重復(fù) 1~3步 25~30輪 目的 DNA片段 擴增 100萬倍以上 DNA雙螺旋 DNA單鏈 與引物復(fù)性 DNA變性 形成2條單鏈 子鏈延伸 DNA加倍 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 1 2 3 4 5 22 55 72 94 時間（ min） 溫度 （ ℃ ） 適溫延伸 3 高溫變性 1 低溫退火 2 重復(fù) 1~3步 25~30輪 目的 DNA片段 擴增 100萬倍以上 DNA雙螺旋 DNA單鏈 與引物復(fù)性 子鏈延伸 DNA加倍 DNA變性 形成2條單鏈 模板 DNA 95℃ PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 50℃ 引物 1 引物 2 DNA引物 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 引物 1 引物 2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 第 1輪結(jié)束 第 2輪開始 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 72℃ 第 2輪結(jié)束 PCR的反應(yīng)體系 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 標(biāo)準(zhǔn)的 PCR反應(yīng)體系 4種 dNTP混合物 各 200umol/L 引物 各 10～ 100pmol 模板 DNA ～ 2ug Taq DNA聚合酶 Mg2+ PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 ? 靈敏度高 (pg=1012)量級擴增到微克 (ug=106)水平 100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞 3個 RFU 3個細(xì)菌 ? 簡便、快速 ， 2～ 4 小時完成擴增 ? 對標(biāo)本的純度要求低 ?血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提 DNA PCR的應(yīng)用 ? 研究 – 基因克隆， DNA測序，分析突變 ? 診斷 – 細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷 ? 人類基因組工程 – 遺傳圖譜的構(gòu)建， DNA測序，表達圖譜 ? 法醫(yī) – 犯罪現(xiàn)場標(biāo)本分析 ? 腫瘤 – 各種腫瘤檢測 ? 其他 …… 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH
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