【正文】 的幾乎所有真核生物中，大腸桿菌中也存在 RNA干擾現(xiàn)象。 雙鏈小分子 RNA可高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源 mRNA，阻斷靶基因表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型，這種現(xiàn)象稱為 RNA干擾 (RNAi)。 這些雙鏈小 RNA稱 siRNA(Small/short interfering RNA, siRNA)。 引發(fā) RNAi的雙鏈 RNA長(zhǎng)度必須在 30nt以上，具有 539。P、339。OH基團(tuán)，且 339。端有兩個(gè)突出的堿基。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 71 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 72 miRNA 研究發(fā)現(xiàn) miRNA的主要功能是調(diào)節(jié)生物體內(nèi)在的與機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育、疾病發(fā)生過程有關(guān)的基因的表達(dá)，而且研究人員推測(cè)這種小分子調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 73 MicroRNA也可以寫做 miRNA ，是一種 21－25nt長(zhǎng)的單鏈小分子 RNA。它廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，其本身不具有開放閱讀框（ ORF）。成熟的 miRNA， 5′端有一個(gè)磷酸基團(tuán)， 3′端為羥基。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 74 編碼 miRNAs的基因最初產(chǎn)生一個(gè)長(zhǎng)的 priRNA分子，這種初期分子還必須被剪切成約 7090個(gè)堿基大小、具發(fā)夾結(jié)構(gòu)單鏈 RNA前體（ premiRNA）并經(jīng)過 Dicer酶加工后生成。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 75 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 76 MiRNA的作用方式 miRNA基因是一類高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分為兩種：第一種以線蟲lin4為代表，作用時(shí)與靶標(biāo)基因不完全互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而抑制翻譯而不影響 mRNA的穩(wěn)定性（不改變 mRNA豐度），這種 miRNA是目前發(fā)現(xiàn)最多的種類； 第二種以擬南芥 miR171為代表，作用時(shí)與靶標(biāo)基因完全互補(bǔ)結(jié)合，作用方式和功能與siRNA非常類似，最后切割靶 mRNA； ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 77 MiRNA的特異性 研究表明 MiRNAs在物種間具有高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性 —— 在特定的時(shí)間、組織才會(huì)表達(dá)。 擬南芥中的 miR171僅在其花序中高水平表達(dá)，在某些組織低水平表達(dá)，在莖、葉等組織中卻無任何表達(dá)的跡象； 2024h的果蠅胚胎提取物中可發(fā)現(xiàn) miR12，卻找不到 miR3miR6，在成年果蠅中表達(dá)的 miR1和 let7也無法在果蠅胚胎中表達(dá)。 MiRNA表達(dá)的時(shí)序性和組織特異性暗示 miRNA的分布可能決定組織和細(xì)胞的功能特異性，也可能參與了復(fù)雜的基因調(diào)控，對(duì)組織的發(fā)育起重要作用。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 78 相同點(diǎn)： MiRNA和 siRNA都是由 22個(gè)左右的核苷組成； 它們都是 Dicer酶的產(chǎn)物； 它們都會(huì)和 RISC復(fù)合體結(jié)合； 它們都可以抑制靶標(biāo)基因的翻譯； ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 79 兩者之間的主要差異： 起源階段 SiRNA：通常是外源的，如病毒感染和人工插入的 dsRNA被剪切后產(chǎn)生外源基因進(jìn)入細(xì)胞（注：病毒入侵，或者是自身合成 RNA中出現(xiàn)錯(cuò)誤，細(xì)胞內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生雙鏈 RNA，來阻止這些異?；虻谋磉_(dá)）。 MiRNA：是內(nèi)源性的，是一種非編碼的 RNA；由 miRNA基因表達(dá)出最初的 primiRNA分子。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 80 成熟過程 SiRNA：直接來源是長(zhǎng)鏈的 dsRNA（通常為外源）；經(jīng)過 Dicer酶 *切割形成雙鏈 siRNA,而且每個(gè)前體dsRNA能夠被切割成不定數(shù)量的 siRNA片段。 MiRNA：在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄的較大的 primiRNA經(jīng)由Drosha(一種 RNAse Ⅲ 酶 ) 加工成為單鏈 premiRNA；接著，發(fā)夾狀、部分互補(bǔ)的 premiRNA在細(xì)胞質(zhì)中被 Dicer*（一種 RNAse Ⅲ 酶）酶切割形成 miRNA；在生物體中的表達(dá)具有時(shí)序性、保守性和組織特異性。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 81 功能階段 miRNA可抑制靶標(biāo)基因的翻譯，也可導(dǎo)致靶標(biāo)基因降解，即在轉(zhuǎn)錄水平后和翻譯水平起作用；而 siRNA只能導(dǎo)致靶標(biāo)基因的降解，即為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控； ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 82 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn) (electrophoretic mobility shift assay, EMSA) 是體外分析 DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù) 。 原理：在凝膠電泳中 ， 由于電場(chǎng)的作用 ， 裸露的 DNA朝正電極移動(dòng)的距離與其分子量的對(duì)數(shù)成反比 。 如果此時(shí)DNA分子與某種蛋白質(zhì)相結(jié)合 ， 那么由于分子量增大 ，它在凝膠中的遷移作用便會(huì)受到阻滯 ， 在特定電壓和時(shí)間內(nèi)朝正電極移動(dòng)的距離也就相應(yīng)縮短了 ， 所以當(dāng)某個(gè)DNA片段與細(xì)胞提取物混合之后 ， 如果它在凝膠電泳中的移動(dòng)距離變小了 ， 就說明它可能已與提取物中的某種特殊蛋白質(zhì)分子相結(jié)合 。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 83 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 84 EMSA還用于研究與蛋白質(zhì)相結(jié)合的 DNA序列的特異性。 通過設(shè)計(jì)一系列引入一個(gè)或數(shù)個(gè)突變堿基的放射性標(biāo)記探針，運(yùn)用 EMSA來評(píng)估這些突變對(duì)探針 DNA與結(jié)合蛋白相互作用的影響，進(jìn)而確定該探針 DNA分子中與蛋白質(zhì)直接發(fā)生相互作用的關(guān)鍵性堿基。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 85 ● ●