分子生物學(xué)技術(shù)(2)-資料下載頁
2025-01-13 07:55本頁面
【正文】 ，降低游離Mg2+的濃度，從而影響酶的活性。 當(dāng) dNTP濃度為 200umol/L， MgCl2的濃度為。 （二） PCR的反應(yīng)條件 ?反應(yīng)溫度 （ 變性 、 退火 、 延伸 ） ?反應(yīng)時間 （ 變性 、 退火 、 延伸 ） ?循環(huán)次數(shù) （ PCR效率及產(chǎn)物量 ） 溫度 變性溫度： 94 ~ 97 ℃ 退火溫度： 低于引物 Tm 5 ℃ 左右 溫度過高 降低擴增效率； 溫度過低 增加非特異性擴增 延伸溫度： 72℃ ，此時 Taq酶具有較高的酶促活性 時間 ?第一次變性應(yīng)給予足夠時間 （ 5 ~ 7分鐘 ） ?每個步驟所需時間取決于擴增片段的長度，一般為 30秒 ~ 1分鐘 ，時間過長易導(dǎo)致非特異性擴增。 循環(huán)次數(shù) ?重復(fù)次數(shù)一般設(shè)為 25~35個循環(huán) ?擴增反應(yīng)的平臺效應(yīng)： 理論上， PCR反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)性增長，但這種增長形式在擴增 2525個循環(huán)以后便放慢直至停止，達到反應(yīng)平臺，此時擴增產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長。 三、 PCR中試劑與樣本的保存 裂解液 4℃ 貯存，避免反復(fù)凍融，否則影響裂解效果，造成假陰性。 反應(yīng)液 20℃ 貯存。試劑開封后， 4℃ 保存在1~2周內(nèi)用完。反應(yīng)液反復(fù)凍融 5次影響不大，但過多的凍融會降低擴增效率。 （一）試劑貯存 Taq酶 20℃ 貯存（存于有霜冰箱）。 陽性模板 20℃ 貯存，可反復(fù)凍融 5次左右。陽性模板 4℃ 也可貯存 2周左右。 尿道、陰道、宮頸分泌物 棉拭子經(jīng)生理鹽水洗滌后，2022r/min后取上清 500ul。 過多的沉淀物裂解后，會導(dǎo)致 PCR抑制而產(chǎn)生假陰性結(jié)果，或出現(xiàn)電泳背景模糊和拖尾現(xiàn)象。尤其是膿性分泌物，沉淀物過多，易造成假陰性。 （二）標(biāo)本處理 尿液 男性尿道炎患者，若無分泌物，可用初段尿。尿液置冷凍保存，但解凍后需 37℃ 保溫，以使尿鹽充分溶解，過多的鹽沉積物會抑制 PCR。 血清 乙型肝炎病毒，血清可置 4℃ 貯存幾天， 20℃ 貯存三個月以上不影響檢測結(jié)果，經(jīng)多次凍融也不影響檢測結(jié)果。 丙型肝炎病毒等，血清必須置 20℃貯存，一般凍融 3次以上便會影響檢測結(jié)果，導(dǎo)致假陰性。 全血 盡快處理（一般不超過 24h）， 因為白細胞會隨時間的延長而減少。處理時盡量將紅細胞去除干凈。紅細胞末去除干凈，將干擾 PCR， 導(dǎo)致擴增效率下降。 痰液 先用 1N NaOH液化， 37℃ ~50℃ 可縮短液化時間，長時間的液化（過夜或數(shù)天）不影響結(jié)核菌的檢測。 痰液消化后，均要用蒸餾水洗滌離心沉淀物 12次，否則，沉淀物過堿而抑制PCR。 胸水、腦脊液 胸水、腦脊液標(biāo)本離心所得沉淀物極少，加裂解液的量也要相應(yīng)減少。為保證裂解充分，可在管內(nèi)滴入 12滴石蠟油后再裂解。 （三）樣本保存 送檢標(biāo)本不能及時處理，除全血外，均可置 20℃ 保存數(shù)天。 處理好的標(biāo)本可置 20℃ 保存。檢測時需將解凍后的標(biāo)本充分振蕩，經(jīng) 100℃ 水浴 5min， 離心后取上清液檢測。 以 PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù) ? 逆轉(zhuǎn)錄 PCR (reverse transcription PCR, RTPCR) ? 定量 PCR (quantitative PCR ) ? 多重 PCR (multiplex PCR) ? 免疫 PCR ? 差異顯示 PCR (differential display PCR, DDPCR) ? PCR誘導(dǎo)定點突變 ? 原位 PCR (in situ PCR) PCR技術(shù)在分子診斷中的應(yīng)用 ?感染性疾病中病原微生物核酸的檢測 ?單基因遺傳性疾病的基因診斷 ?多基因病相關(guān)基因的檢測 ?腫瘤相關(guān)基因的檢測 ?移植配型和法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用
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