質(zhì)粒分子生物學(xué)與質(zhì)粒技術(shù)-資料下載頁
2025-01-07 09:29本頁面
【正文】 度 。 轉(zhuǎn)化效率 （ transformation efficiency） ：每 mg DNA產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子數(shù) ， 測定時(shí)使用亞飽和 DNA濃度 。 4 細(xì)菌雜交實(shí)驗(yàn) ① 濾膜雜交：混合供體和受體菌培養(yǎng)物 ， 用孔徑為 ， 帶菌的濾膜在營養(yǎng)平板上培養(yǎng)過夜 ， 用無菌水洗下膜上的細(xì)菌 ， 涂選擇平板 ， 篩選接合體 。 ② 平板雜交：在選擇平板上涂布供體菌和受體菌的混合物或分別劃線受體菌和供體菌 ， 培養(yǎng)過夜 ， 長出的菌落為接合體 。 ③ 液體雜交：靜止培養(yǎng)供體菌和受體菌的混合物 ， 然后涂選擇平板 ， 篩選接合體 。 例： PpG378 (LeuNah+) PpG376 (Leu+Nah) 5 質(zhì)粒的限制酶作圖 制作質(zhì)粒限制圖的方法主要有直接酶切法 、 重疊片段克隆法和測序法 。 直接酶切法是通過限制酶的完全消化和部分消化 ， 確定各種限制酶切割位點(diǎn)在質(zhì)粒中的位置 ， 適用于小質(zhì)粒；重疊片段克隆法是先進(jìn)行限制片段的克隆 ， 確定每個(gè)克隆片段的限制酶位點(diǎn) ， 以及各克隆片段在質(zhì)粒中的排列順序 ， 最后得到整個(gè)質(zhì)粒的限制圖 ，適合于較大的質(zhì)粒 。 最理想的方法是先測定質(zhì)粒的核苷酸序列 ， 然后根據(jù)限制酶的識別序列用計(jì)算機(jī)作圖 ， 適合于所有質(zhì)粒 ， 特別是巨型質(zhì)粒 。 ② （ 重疊片段克隆法 ） 作圖策略： a. HindⅢ 、 EcoRⅠ 和 XbaⅠ 單酶消化：測定限制片段大小和切點(diǎn)數(shù) 。 b. HindⅢ 完全消化 → 片段克隆 → HindⅢ + EcoRⅠ 消化：確定 HindⅢ 片段中的 EcoRⅠ位點(diǎn) c. HindⅢ 部分消化 → 片段克?。? HindⅢ 消化 ， 確定 HindⅢ 片段排列順序 EcoRⅠ 消化 ， 確定 EcoRⅠ 位點(diǎn) EcoRⅠ + XbaⅠ 消化 ， 確定 XbaⅠ 位點(diǎn) 6 質(zhì)?；蚨ㄎ唬恨D(zhuǎn)座子插入突變法 把攜帶轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒引入含有待測質(zhì)粒的細(xì)胞中 ， 篩選并收集含有插入突變的細(xì)胞 ， 通過限制酶分析確定插入位點(diǎn) ， 然后測定含有轉(zhuǎn)座子插入的細(xì)胞其待測基因是否失活 ， 從而確定基因的大概位置 。 圖 210 阿特拉津氯水解酶基因 atzA的定位 7 質(zhì)粒測序和基因注釋 (annotation) 質(zhì)粒測序：用鳥槍克隆法 ， 將純化的質(zhì)粒用超聲波打碎 ， 用瓊脂糖凝膠電泳分離 1２ kb片段 ，補(bǔ)平片段末端 ， 與平末端 pUC18連接 ， 電轉(zhuǎn)化 E. coli DH5α， 篩選有插入片段的 轉(zhuǎn)化子 ， 測定克隆片段的序列 ， 根據(jù)測序結(jié)果拼接質(zhì)粒序列 ， 空缺部分用 PCR方法補(bǔ)齊并測序 。 質(zhì)?；蜃⑨專合?GenBank注冊質(zhì)粒序列 ，報(bào)告每個(gè)編碼序列 （ CDS， 或稱 ORF） 的基因名稱 、 位置 、 功能和翻譯產(chǎn)物 。 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體 載體的類型： ① 自主復(fù)制的瞬時(shí)表達(dá)載體：帶有真核病毒復(fù)制子。 ② 與寄主基因組整合的表達(dá)載體：不含病毒復(fù)制子。 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件： ① 原核細(xì)胞復(fù)制原點(diǎn)和篩選基因 (抗生素抗性 )。 ② 真核啟動子和增強(qiáng)子元件 。 ③ 能進(jìn)行染色體外復(fù)制的病毒復(fù)制子序列 。 ④ 在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的選擇標(biāo)記基因 (抗生素或藥物抗性 )。 ⑤ 終止和加 poly(A)的信號序列 。 ⑥ 帶有剪接供體和剪接受體功能位點(diǎn)的內(nèi)含子序列 (用于 mRNA剪接 ) ⑦ 多克隆位點(diǎn) 。 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體對克隆基因的要求： ① 一般使用 cDNA。 ② 克隆基因必須帶有天然的 rbs 和單一的起始密碼子 AUG。 圖 221 瞬時(shí)表達(dá)載體 pMSG 圖 222 制備等基因表達(dá)的 FlpInTM 寄主細(xì)胞系 (invitrogen 公司 ) 圖 223 制備 FlpInTM 表達(dá)細(xì)胞系 (invitrogen 公司 )
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