分子生物學(xué)研究法(下)-資料下載頁
2024-12-28 05:12本頁面
【正文】 降解； Ⅱ 類反義 RNA與 mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，引起 mRNA構(gòu)象變化，抑制翻譯； Ⅲ 類反義 RNA則直接抑制靶 mRNA的轉(zhuǎn)錄。 反義 RNA技術(shù)示意圖7 研究基因差異表達的主要技術(shù)差別雜交（篩選） （ differential hybridization）扣除（消減）雜交 （ subtractive hybridization of cDNA， SHD）mRNA差異顯示 （ mRNA differential display， DD）抑制消減雜交法 （ suppression subtractive hybridization, SSH）代表性差異分析 （ represential display analysis， RDA）交互扣除 RNA差別顯示 （ reciprocal subtraction differential RNA display）基因表達系列 （ serial analysis of gene expression， SAGE） 分析電子消減 （ electronic subtraction）DNA微列陣分析 （ DNA microarray） 根據(jù)表達特性的差異可將高等真核生物的基因分為兩大類：一類叫做 看家基因 （ housekeeping gene），以其組成型表達模式維持細(xì)胞的基本代謝活動 。 而把在生物個體發(fā)育的不同階段，或是在不同組織或細(xì)胞中發(fā)生的按時間、空間進行有序表達的基因稱為 差別表達（ differential expression）基因 。 1992年，美國波士頓 DenaFarber癌癥研究所的兩位科學(xué)家 P. Liang和 A. D. Pardee發(fā)明了一種叫做 mRNA差別顯示PCR（ mRNA differential display）技術(shù)，簡稱 DDRTPCR，可以從一對不同基因型的細(xì)胞群體所產(chǎn)生的約 15,000種mRNA中有效地鑒定并分離出差別表達的基因。216。 基因的差別表達DDRTPCR的主要操作步驟如下：（ 1）從不同發(fā)育階段或不同基因型的細(xì)胞群體中分離 mRNA，并以 339。錨定引物作為反轉(zhuǎn)錄的引物，合成第一鍵 cDNA；（ 2）用 539。隨機引物和 339。端錨定引物對擴增第一鏈 (摻入 32PdNTP).（ 3）用 DNA變性測序膠分離擴增產(chǎn)物， X光片曝光后檢測差別條帶；（ 4）回收特異性差別條帶；（ 5）用同一引物對擴增已回收的 DNA條帶；（ 6）用 Northern， Southern及測序法分析所得的條帶；（ 7）以該 DNA片段做探針，篩選全長 cDNA或核基因。（ 1） mRNA差異顯示 （ mRNA differential display， DD） 是基于消減雜交和抑制 PCR技術(shù)發(fā)展起來的一種分離差異表達基因的新方法，主要用于分離兩種細(xì)胞或組織中的差異表達基因。通過合成兩個不同的接頭，接于經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后的測試 cDNA片段的 5ˊ 末端，將測試（ tester)和驅(qū)動 (driver)進行兩輪消減雜交，以除去它們之間的共同序列。利用抑制 PCR對差減雜交后豐度一致的目的材料中兩端連有不同接頭的差異表達片段進行指數(shù)擴增，而兩端連接上同一接頭的同源雙鏈片段僅呈線性擴增，從而達到富集差異表達基因的目的。 所謂抑制性 PCR是利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火的原理，使非目的序列片段兩端的長反向重復(fù)序列在退火時產(chǎn)生 “ 鍋柄樣 ” 結(jié)構(gòu)，無法與引物配對，從而選擇性抑制非目的序列片段的擴增。（ 2）抑制消減雜交法 （ suppression subtractive hybridization, SSH）謝謝！謝謝觀看 /歡迎下載BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAIT
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