分子生物學(xué)方法-資料下載頁
2025-01-01 03:23本頁面
【正文】 從而能有效重組。 ?在連接反應(yīng)中，使用正確的載體 DNA和外源DNA的比例，是獲得高產(chǎn)重組轉(zhuǎn)化子的重要因素。 ?用 λ噬菌體或柯斯質(zhì)粒作載體時，配制高比值的載體 DNA/供體 DNA的連接反應(yīng)體系有利于重組分子的形成。 ?用質(zhì)粒作為克隆載體，其重組體分子由一個載體分子和一個供體 DNA片段連接環(huán)化而成，當(dāng)載體 DNA與供體 DNA的比值為 1時，有利于這類重組體分子的形成。 3重組體分子導(dǎo)人受體細胞的途徑 ?將外源重組體分子導(dǎo)人受體細胞的主要途徑包括轉(zhuǎn)化 (或轉(zhuǎn)染 )、轉(zhuǎn)導(dǎo)、顯微注射和電穿孔等。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)主要適用于細菌一類原核細胞和酵母等低等真核細胞，而顯微注射和電穿孔則主要應(yīng)用于高等動物的真核細胞。在基因工程中有詳細介紹。 543 cDNA基因克隆 ?真核生物基因組 DNA大，含有大量的重復(fù)序列和內(nèi)含子，難以直接分離到目的基因。通過 RTPCR可以部分解決。 ?高等生物一般具有 3～ 5萬種左右不同的基因，在一定時間階段的單個細胞或組織中，僅有15%左右的基因得以表達，產(chǎn)生出約 5000～10000種不同的 mRNA分子。 總 RNA的提取 ? rRNA80%~85%， tRNA15%~20%，mRNA1%~5%。 ?異硫氰酸胍－苯酚 Trizol box. 破壞細胞機構(gòu)，釋放 RNA，核糖體蛋白與 RNA分離，保證RNA完整。氯仿沉淀蛋白。異丙醇沉淀RNA。乙醇洗滌 RNA。 OD260為 1時， 40181。 g/mL. OD260/ OD280=~ RNA程度好，低于 。電泳看18S和 28S. ?cDNA克隆的基本過程是通過一系列酶催作用，使總 poly(A)mRNA轉(zhuǎn)變成雙鏈 cDNA群體并插入到適當(dāng)?shù)妮d體分子上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌寄主菌株細胞，構(gòu)成包含所有基因編碼序列的 cDNA基因文庫。 1高質(zhì)量 mRNA的制備 ? 可應(yīng)用 Promega PolyAT tract mRNA分離系統(tǒng)分離poly(A)mRNA。將用生物素標(biāo)識的寡聚 (dT)引物與細胞總 RNA共溫育，加入與微磁球相連的抗生物素蛋白，用磁場吸附通過寡聚 (dT)引物與抗生物素蛋白及強力微磁球相連的mRNA。 2反轉(zhuǎn)錄生成 cDNA ? mRNA5’ —————————— AAAA ?互補 21CCC———————— TTTT20 ? 21GGG ?所有包含 Poly(A)尾巴的 mRNA被反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。 ?以 21和 20為引物做 PCR： ? 21－－－－－－－－－－ AAAA20互補 ?互補 21————————————— 20 重組體分子的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化寄主菌株 ?雙鏈 cDNA群體插入載體： ? 21－－－－－－－－－－ AAAA20互補 ?互補 21————————————— 20 ?設(shè)計 21時，讓其有酶 1的切點， 20有酶 2的切點，在質(zhì)粒載體上有相應(yīng)的切點，就可以定相將所有 PCR片段插入載體。 ?轉(zhuǎn)化大腸桿菌寄主菌株細胞，構(gòu)成包含所有基因編碼序列的cDNA基因文庫。 ?載體分子有抗藥性基因，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的抗生素進行篩選。 ?經(jīng)過特殊處理的具有吸收外源 DNA能力的細菌細胞為感受態(tài)細胞。 ?當(dāng)重組質(zhì)粒分子與感受態(tài)細胞混合，感受態(tài)細胞數(shù)量 》重組質(zhì)粒分子時，在培養(yǎng)基上長出的單菌落是由一個重組質(zhì)粒分子導(dǎo)入一個細菌細胞后經(jīng)過繁殖而形成的。 ?在組織和培養(yǎng)的細胞中，一個細胞中有些 mRNA可擁有數(shù)千個拷貝，而有些 mRNA只有幾個拷貝。根據(jù) mRNA分子含量的多寡，可以將 mRNA劃分為高豐度、中豐度和低豐度 3種不同的類型。 ?從表中看出低豐度 mRNA，其總量約占總 mRNA的 30%，約有 11000個左右的不同種類的 mRNA。如果獲得 11000個克隆，得到每一種低豐度 mRNA的可能只有 30％，因此，為了獲得一個能夠代表全部低豐度mRNA序列的 cDNA基因文庫，必須的最低克隆數(shù) (理論值 )應(yīng)是11000/030≈37000。 ?由于在實驗中存在著取樣差異，有些序列容易被克隆，有些序列不容易被克隆，為了保證 cDNA文庫中能夠包含所有的序列，必須增加克隆的數(shù)目。為了使低豐度 mRNA的cDNA克隆達到 99%的期望率，需要篩選 170000個克隆。 RACE(rapid amplification of cDNA)技術(shù) ?可以擴增缺失的 DNA序列。 ?可以完成 3’和 5’的未知序列的擴增。 5’擴增 3’擴增 544 克隆基因的分離 ?1應(yīng)用核酸探針分離克隆目的基因 : 把 cDNA文庫轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，就可以與特異性的核酸探針進行菌落雜交，以便篩選出具有目的基因的陽性克隆，這個過程叫作克隆基因的分離或篩選。 ?應(yīng)用核酸探針分離目的基因的方法叫作核酸雜交篩選法。適用于大規(guī)模篩選。只要有合適的現(xiàn)成可用的核酸探針，就有可能從生物體的任何組織中分離到目的基因，也就能夠有效地檢測任何一種插入的外源DNA序列。 ?分離克隆基因的辦法很多，根據(jù)不同的需要再去學(xué)習(xí)具體的方法，這里就不作一一介紹了。 思考題 ? PCR的意思、原理和步驟。 ? 已知一個 cDNA的 3’的部分序列，請設(shè)計實驗流程得到該基因的全長 cDNA。 ? 敘述 Southern blotting的基本步驟。 ? 提取真核生物總 RNA的檢測標(biāo)準(zhǔn)。 ? 簡述堿變性法提取質(zhì)粒 DNA的原理及方法。 ? 簡述凝膠電泳分離 DNA的要點。 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH
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