【正文】 發(fā)生遺傳改變的生命過程。 5（ d）在 80℃ 下烘烤 1～ 2h或用紫外線交聯(lián)法將 DNA片段永久性地固定在濾膜上并形成單鏈。 ?基因組 DNA被限制性內(nèi)切酶酶切為 DNA片段；各片段經(jīng)電泳后在凝膠分為條帶；（ c）中由下到上是：玻璃板、一層濾紙、凝膠、濾膜、很多層濾紙、玻璃板、重物。 用漂洗法去掉沒有雜交上的探針分子。 放入探針溶液中進行核酸雜交。具體步驟： 轉(zhuǎn)移。 ?核酸分子雜交包括兩個步驟：第一，將樣品轉(zhuǎn)移到濾膜（印跡轉(zhuǎn)移） 。Southern于 1975年首先設計出來的，所以又叫做 Southern blotting。由于該方法是 E因此， DNA/DNA的雜交作用，可以用來檢測特定生物有機體之間是否存在著親緣關系，而形成 DNA/RNA間雜種分子的能力可被用來揭示核酸片段中某一特定基因的位置。如果退火的核酸來自不同的生物有機體，所形成的雙鏈分子就被稱為雜種核酸分子。在適當?shù)娜旧珬l件下，熒光強度與 DNA片段的數(shù)量成正比。把 EB直接加到凝膠介質(zhì)中，染料便會與 DNA分子結(jié)合，卻不能與凝膠相結(jié)合。 ?在凝膠電泳中，加入適量嗅化乙錠 (ethidium bromide，簡稱 EB)染料對核酸分子進行染色，然后將電泳標本放置在紫外光下觀察，檢測靈敏快捷， DNA帶中含 DNA，可以清晰地檢測出來。例如， 20%的聚丙烯酰胺凝膠可分離 16bp的 DNA小片段，而若要分離1000bp的 DNA片段，就要用 3%的聚丙烯酰胺凝膠。聚丙烯酰胺凝膠分辨范圍為 1～1000bp之間。經(jīng)過化學修飾的低熔點瓊脂糖，在較低的溫度下便會熔化，常用于 DNA片段的制備電泳。瓊脂糖凝膠電泳 ?瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。這就是應用凝膠電泳技術(shù)分離 DNA片段的基本原理。由于糖 磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。根據(jù)分子大小、構(gòu)型或形狀的差異和帶凈電荷數(shù)，可通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離。分子在電場作用下的遷移速度，與電場強度和電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與分子的摩擦系數(shù)成反比?；驹? 生物大分子在一定 pH條件下，通常會帶電荷。2風干沉淀。6～ 1倍體積的異丙醇 (沉淀 DNA)，混勻。加等體積氯仿，混勻， 12023r/min，離心 5min，取上清。將上清液轉(zhuǎn)移到另一 EP管中。從水浴中取出離心管，加入20?L5mol/LKCl溶液，混勻，冰浴 20min。加入 740?L細胞提取液，充分混勻。5mol/L KCl ?將細胞提取液、 KCl溶液及容器滅菌。HCl=50/ pH8酚 ?試劑 1加樣槍和吸頭 13十二烷基硫酸鈉 (SDS) 10乙醇 8氯化鉀 6氯化鈉 4三羥甲基氨基甲烷 (Tris) 2再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的 DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀。細胞提取液中含有的 SDS溶解膜蛋白而破壞細胞膜，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。 5 ?此后，大量類似于 EroRl但具有獨特識別序列的核酸內(nèi)切酶被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。 1972， Boyer實驗室發(fā)現(xiàn)核酸內(nèi)切酶 EcoRI能特異識別GAAUC序列，將 DNA在這個位點切開產(chǎn)生具有粘性末端的小片段。這些酶的發(fā)現(xiàn)和應用是現(xiàn)代生物工程技術(shù)史上最重要的事件。 ? DNA分子體外切割與連接技術(shù)及核苷酸序列分析技術(shù)的進步直接推動了重組 DNA技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展。 第二， DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復制機制，解決了 基因的自我復制和世代交替問題 。 5 ?跨越天然物種屏障、把來自任何生物的基因置于毫無親緣關系的新的寄主生物細胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其他技術(shù)的根本特征。這是分子生物學研究的核心技術(shù)。分子生物學研究方法 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件 DNA操作技術(shù) 基因克隆的主要載體系統(tǒng) 基因的分離與鑒定 ?分子生物學從 20世紀中葉開始高速發(fā)展，最主要的原因之一是基因操作和基因工程技術(shù)的進步?；虿僮鳎?DNA的切割和連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析、基因的人工合成、定點突變和 PCR擴增。 基因工程： 在體外將核酸分子插入載體分子中，使之進入寄主細胞內(nèi)并進行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達。本章將在回顧重組 DNA技術(shù)史上主要事件的基礎上，討論 DNA操作技術(shù)、基因克隆的常用載體系統(tǒng)以及基因的分離與鑒定等 3個環(huán)節(jié)。1 重組 DNA技術(shù)史上的重大事件 ?半個世紀以來，分子生物學研究取得了前所未有的進步，主要有 3大成就 : 第一，解決了遺傳的物質(zhì)基礎問題 －－基因的分子載體是DNA。 第三，“中心法則”和操縱子學說，成功地破譯了遺傳密碼，闡明了 遺傳信息的流動與表達機制。 ?重組 DNA的核心是用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶對 DNA分子進行體外切割和連接。限制性核酸內(nèi)切酶能從特定堿基序列位點切開 DNA。 ?他們還發(fā)現(xiàn)， EcoRl酶切產(chǎn)生的任何不同來源的 DNA片段能通過粘性末端之間堿基互補作用而彼此“粘合”起來。到目前為止，科學家已經(jīng)幾乎能隨心所欲地把任何 DNA分子切割成一系列不連續(xù)的片段，再利用凝膠電冰技術(shù)將這些片段按照分子量大小逐一分開，以供下一步研究。2 DNA操作技術(shù) ?植物基因組 DNA的提?。阂旱獙χ参锝M織進行研磨－－破碎細胞。 EDTA抑制 DNA酶的活性。 ?材料 1乙二胺四乙酸 (EDTA) 3?－巰基乙醇 5異丙醇 7瓊脂糖 9EP管 11，陶瓷研缽 12氯仿 14細胞提取液（ 100mmol/L Tris0） (100mL分裝為10mL)， 5mmoI/L EDTA， 500mmol/L NaCl % SDS lmol/L ?－琉基乙醇 2新鮮葉片，在液氮中研磨，分裝在 2只 EP管中。 65℃ 水浴保溫 20min。8000r/min離心 10min。加等體積酚 /氯仿混勻，2023r/min離心 5m