分子生物學(xué)檢查-資料下載頁(yè)
2024-12-28 03:46本頁(yè)面
【正文】 板變性 2 模板與引物結(jié)合 3 引物延伸 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR） PCR條件的優(yōu)化 1 模板核酸： 來(lái)源廣泛、需部分純化、去除 DNA聚合酶抑制劑 一般宜用 ng級(jí)的克隆 DNA， ?g水平的染色體 DNA或 104拷貝的待擴(kuò)增模板 用于檢測(cè)目的，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度一般不超過(guò) 500bp，以 100300bp為好 2 引物 應(yīng)純化，濃度不宜過(guò)高 一般終濃度為 ?mol/L 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR） 3 緩沖液 目前最常用 PCR反應(yīng)的緩沖液體系為 1050mmol/L TrisHCl （ ， 20176。C） 偏堿性有利于 Taq DNA聚合酶作用 緩沖液中 50mmol/L KCl利于引物退火 Mg2+對(duì)產(chǎn)量和特異性有顯著影響，過(guò)高特異性下降；過(guò)低產(chǎn)量減少。在各種 dNTP濃度為 200 ?mol/L時(shí) Mg2+為 合適 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR） 4 dNTP 濃度 常采用 50200 ?mol/L的 dNTP 4種 dNTP濃度要一致 5 Taq DNA聚合酶用量 在 100 ?l 總反應(yīng)液中，一般所需 Taq DNA聚合酶用量為 U，通常加入 U，足以達(dá)到每分鐘延伸 10004000個(gè)核苷酸速度 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR） 6 循環(huán)參數(shù) （ 1）變性溫度與時(shí)間 94 176。C 30s （ 2）退火溫度與時(shí)間 退火溫度決定反應(yīng)特異性 取決于引物的長(zhǎng)度、濃度和堿基組成（ G+C含量）。長(zhǎng)度為 1525bp時(shí)，退火溫度可根據(jù) Tm=4（ G+C）+2（ A+T） （ 3）延伸溫度與時(shí)間 72 176。C 待擴(kuò)增片段〈 1kb， 1min；〉 1kb 34min （ 4）循環(huán)次數(shù) 2025個(gè)循環(huán) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR） PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析法 （ 1）凝膠電泳法 （ 2）點(diǎn)雜交分析結(jié)果 （ 3）微孔板夾心雜交法 （ 4） PCRELISA法 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 概念： 當(dāng) DNA序列差異發(fā)生在限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，或當(dāng) DNA片段的插入、缺失或重復(fù)致使基因組 DNA 經(jīng)限制性內(nèi)切酶水解發(fā)生片段改變。這種在同種生物不同個(gè)體間出現(xiàn)不同長(zhǎng)度限制性片段類(lèi)型，就是限制性片段多態(tài)性（ RFLP） 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 人類(lèi)基因組存在兩類(lèi)多態(tài)性： 1 限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)改變?cè)斐傻?RFLP 2 串聯(lián)重復(fù)順序拷貝數(shù)不同造成的多態(tài)性）VNTR） RFLP可用于遺傳病的產(chǎn)前診斷等 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH
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