【正文】 止位點（terminus）。原核生物的整個染色體上一般只有一個復(fù)制起始位點。 大腸桿菌DNA的復(fù)制需要有20種左右的酶和蛋白質(zhì)因子參與，整個DNA復(fù)制機器被稱之為DNAreplicasesystem或replisome。 Helicase，任何DNA在被復(fù)制前都必須解開雙鏈，這個過程是由helicase來完成的，它可在ATP的作用下將DNA母鏈不斷解開形成單鏈。 Topoisomerase，主要功能是消除DNA解鏈過程中所產(chǎn)生的扭曲力。 DNA結(jié)合蛋白，使新解鏈的DNA保持穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。 Primases，為DNA復(fù)制提供RNA引物。 DNApolymerases，合成新生DNA鏈，切除RNA引物。 DNALigases，使新生DNA鏈上的缺口（3’OH,5’p）生成磷酸二酯鍵。 1.DNA復(fù)制的起始 大腸桿菌中的復(fù)制起始位點是OriC，全長245Bp，該序列在所有細(xì)菌復(fù)制起始位點中都是保守的。 DNA復(fù)制起始中的主要步驟 a.大約20個左右的DnaA蛋白首先與OriC中的4個9堿基重復(fù)區(qū)相結(jié)合； b.識別并使3個13堿基串聯(lián)重復(fù)區(qū)DNA形成開環(huán)結(jié)構(gòu)； c.DnaB蛋白在DnaC的幫助下與未解鏈序列結(jié)合。每六個DnaB蛋白形成一組并與一條DNA母鏈結(jié)合，可在不同方向同時起始DNA的復(fù)制。當(dāng)細(xì)胞中存在足夠的SSB和DNAgyrase時，DnaB的解鏈效率非常高。 整個DNA復(fù)制過程中，只有復(fù)制起始受細(xì)胞周期的嚴(yán)格調(diào)控。 Onceineachcellcycle。 DNA甲基化與DNA復(fù)制起始密切相關(guān)。OriC中有11個GATC回文結(jié)構(gòu)（一般說來，256bp才應(yīng)有一個GATC重復(fù)）。DNA子鏈被合成后，母鏈立即被甲基化（稱為hemimethylated）。此時，oriC與細(xì)胞原生質(zhì)膜相結(jié)合。只有當(dāng)oriC被從膜上釋放出來，子鏈被Dam甲基化后，才能有效地與DnaA蛋白結(jié)合，起始新一輪的DNA復(fù)制。復(fù)制起始可能還受ATP水解過程調(diào)控，因為DnaA只有與ATP相結(jié)合時才能與oriC區(qū)DNA相結(jié)合。 2.DNA子鏈的延伸 主要包括兩個不同但相互有聯(lián)系的事件，即前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成。由DNAhelicase解開雙螺旋，由拓樸異構(gòu)酶消除DNA鏈上的扭曲力，SSB結(jié)合使DNA單鏈穩(wěn)定。 前導(dǎo)鏈的合成：由DnaG（primase）在復(fù)制起始位點附近合成一個1060nt的RNA引物，然后由polII把dNTP加到該引物上。 滯后鏈的合成：產(chǎn)生Okazakifragments，消除RNA引物并由DNApolI補上這一小段DNA序列，由DNALigase把兩個片段相連。 3.DNA鏈的終止 當(dāng)子鏈延伸達到terminusregion（ter，帶有多個20bp序列）時，DNA復(fù)制就終止了。Ter有點像一個陷井（trap），使復(fù)制叉只能進入，不能出來。Ter的功能主要是由TerTus復(fù)合物（terutilizationsubstance）來完成的。 4.真核細(xì)胞DNA的復(fù)制比大腸桿菌更復(fù)雜 真核生物的originofreplication被稱為ARSautonomouslyreplicatingsequences或者被稱為replicators。Yeastreplicators長約150dp，有多個保守重復(fù)區(qū)，共有約500個replicators分布于酵母的17條染色體中。 ㈡、DNA的損傷修復(fù) 1．錯配修復(fù)（mismatchRepair） 錯配修復(fù)對DNA復(fù)制忠實性的貢獻力達102103，DNA子鏈中的錯配幾乎完全都被修正，充分反映了母鏈的重要性。 2.堿基切除修復(fù)（BaseExcisionRepair） DNAgylcosylases能特異性識別常見的DNA損傷（如胞嘧啶或腺嘌呤去氨?；a(chǎn)物）并將受損害堿基切除。去掉堿基后的核苷酸被稱為AP位點（apurinicorapyrimidinic）。細(xì)胞中最常見的UracilGlycosylase就能特異性切除細(xì)胞中的去氨基胞嘧啶。 3.核苷酸切除修復(fù)（nucleotideexcisionrepair） 當(dāng)DNA鏈上相應(yīng)位置的核苷酸發(fā)生損傷，導(dǎo)致雙鏈之間無法形成氫鍵，由核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)負(fù)責(zé)進行修復(fù)。 （Directrepair） ㈢、DNA的轉(zhuǎn)座 DNA的轉(zhuǎn)座，或稱移位（transposition），是由可移位因子（transposableelement）介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座這一命名并不十分準(zhǔn)確，因為在轉(zhuǎn)座過程中，可移位因子的一個拷貝常常留在原來位置上，在新位點上出現(xiàn)的僅僅是拷貝。因此，轉(zhuǎn)座有別于同源重組，它依賴于DNA的復(fù)制。 1．轉(zhuǎn)座子的分類和結(jié)構(gòu)特征 a.簡單轉(zhuǎn)座子 轉(zhuǎn)座子（transposon，Tn）是存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和移位的基本單位。 最簡單的轉(zhuǎn)座子不含有任何宿主基因而常被稱為插入序列（insertionsequence，IS），它們是細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成部分。一個細(xì)菌細(xì)胞常帶有少于10個IS序列。轉(zhuǎn)座子常常被定位到特定的基因中，造成該基因突變。IS序列都是可以獨立存在的單元，帶有介導(dǎo)自身移動的蛋白。 （positetransposon）是一類帶有某些抗藥性基因（或其他宿主基因）的轉(zhuǎn)座子，其兩翼往往是兩個相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某個功能基因兩端時就可能產(chǎn)生復(fù)合轉(zhuǎn)座子。一旦形成復(fù)合轉(zhuǎn)座子，IS序列就不能再單獨移動，因為它們的功能被修飾了，只能作為復(fù)合體移動。 轉(zhuǎn)座作用的機制 轉(zhuǎn)座時發(fā)生的插入作用有一個普遍的特征，那就是受體分子中有一段很短的（312bp）、被稱為靶序列的DNA會被復(fù)制，使插入的轉(zhuǎn)座子位于兩個重復(fù)的靶序列之間。不同轉(zhuǎn)座子的靶序列長度不同，但對于一個特定的轉(zhuǎn)座子來說，它所復(fù)制的靶序列長度都是一樣的，如IS1兩翼總有9個堿基對的靶序列，而Tn3兩端總有5bp的靶序列。 轉(zhuǎn)座可被分為復(fù)制性和非復(fù)制性兩大類。在復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，所移動和轉(zhuǎn)位的是原轉(zhuǎn)座子的拷貝。轉(zhuǎn)座酶（transposase）和解離酶（resolvase）分別作用于原始轉(zhuǎn)座子和復(fù)制轉(zhuǎn)座子。TnA類轉(zhuǎn)座主要是這種形式。在非復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，原始轉(zhuǎn)座子作為一個可移動的實體直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以這種方式進行轉(zhuǎn)座。 ①轉(zhuǎn)座引起插入突變。②轉(zhuǎn)座產(chǎn)生新的基因。③轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的染色體畸變。④轉(zhuǎn)座引起的生物進化. 六、RNA代謝 除了某些RNA病毒之外，所有RNA分子都來自于DNA?；蚪MDNA通過一個被稱為轉(zhuǎn)錄的過程把貯存在雙鏈DNA分子中的遺傳信息轉(zhuǎn)換到與模板DNA鏈相互補的RNA單鏈上。 mRNA，編碼了一個或多個蛋白質(zhì)序列；tRNA，把mRNA上的遺傳信息變?yōu)槎嚯闹械陌被嵝畔?；rRNA，是合成蛋白質(zhì)的工廠核糖體中的主要成份。 1．依賴于DNA的RNA合成 從DNA合成反應(yīng)的化學(xué)本質(zhì)、極性和模板的使用這三方面來說，轉(zhuǎn)錄與復(fù)制是相同的。但是，也存在三個主要不同點： A．轉(zhuǎn)錄中不需要RNA引物； B．轉(zhuǎn)錄反應(yīng)一般只用一小段DNA做模板； C．在轉(zhuǎn)錄區(qū)，一般都只有一條DNA鏈可以作為模板。 一旦RNA聚合酶啟動了基因轉(zhuǎn)錄，它就會沿著模板5’→3’方向不停地移動，合成RNA鏈，直到遇到終止信號時才釋放新生的RNA鏈，并與模板DNA脫離。 研究RNA鏈終止時遇到最常見的問題是3’端核苷酸的定位，因為活細(xì)胞內(nèi)部根據(jù)終止信號正確終止的RNA與一個經(jīng)過剪接的RNA在3’端沒有兩樣，都是OH基團。模板DNA上都有終止轉(zhuǎn)錄的特殊信號終止子，每個基因或操縱子都有一個啟動子，一個終止子。在新生RNA中出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致RNA聚合酶的暫停，破壞RNADNA雜合鏈5’端的正常結(jié)構(gòu)。寡聚U的存在使雜合鏈的3’端部分出現(xiàn)不穩(wěn)定的rUdA區(qū)域。 a.依賴于ρ因子的終止 105的六聚體蛋白，它能水解各種核苷三磷酸，實際上是一種NTP酶。由于催化了NTP的水解，ρ因子能促使新生的RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。 有人認(rèn)為，在RNA合成起始以后，ρ因子即附著在新生的RNA鏈上，靠ATP水解產(chǎn)生的能量，沿著5’→3’方向朝RNA聚合酶移動，到達RNA的3’OH端后取代了暫停在終止位點上的RNA聚合酶，并從模板和酶上釋放RNA，完成轉(zhuǎn)錄過程。終止過程需要消耗能量，所以，ρ因子具有終止轉(zhuǎn)錄和核苷三磷酸酶兩種功能。 b、不依賴于ρ因子的終止 若終止點上游存在一個富含GC堿基的二重對稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA容易形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)；在終止點前面有一段由48個A組成的序列，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3‘端為寡聚U。這兩種結(jié)構(gòu)特征的存在同樣決定了轉(zhuǎn)錄的終止。 在新生RNA中出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致RNA聚合酶的暫停，破壞RNADNA雜合鏈5’端的正常結(jié)構(gòu)。寡聚U的存在使雜合鏈的3’端部分出現(xiàn)不穩(wěn)定的rUdA區(qū)域。 TFⅡH還參與DNA的損傷修復(fù)。當(dāng)RNApolⅡ轉(zhuǎn)錄過程中碰到受損傷的核苷酸時，TFⅡH能及時啟動核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)，將損傷修復(fù)。 ActinomycinD和Acridine阻斷RNA鏈的延伸 所以，RNA加工成熟主要包括：5’加帽子結(jié)構(gòu)；3’加多聚A；切除內(nèi)含子 在GroupI內(nèi)含子切除體系中，鳥苷或鳥苷酸的3’OH作為親核基團向Intron5’的磷酸二酯鍵發(fā)起進攻。 GroupII內(nèi)含子切除體系 核內(nèi)mRNA原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪輯方式可能是最常見的。在這一模式中，RNA的剪輯需要特異性RNAprotein復(fù)合物smallnuclearrebonucleoproteins（snRNP）和smallnuclearRNAs（snRNAs）。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少有5種snRNAsU1，U2，U4，U5，U6。 第五講分子生物學(xué)研究法 一、重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件 ，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題； 保留復(fù)制機制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題； ，相繼提出了中心法則和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識了遺傳信息的流動和表達。 年份事件 1869FMiescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNA。 1944.Avery證實DNA是遺傳物質(zhì)。 1952. 1953 1957 1958M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留復(fù)制模型。 19591960S.Ochoa發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶和信使RNA，并證明mRNA決定了蛋白質(zhì)分子中的氨基酸序列。 1961Nirenberg破譯了第一相遺傳密碼；F.Jacob和J.Monod提出了調(diào)節(jié)基因表達的操縱子模型。 1964C.Yanofsky和S.Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列存在著共線性關(guān)系。 1965S.W.Holley完成了酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測定；科學(xué)家證明細(xì)菌的抗藥性通常由質(zhì)粒DNA所決定。 1966，、。 1970 19721973，于72年獲得第一個重組DNA分子，73年完成第一例細(xì)菌基因Aamp。NBSP。CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’amp。NBSP。HREF=’HTTP: Article ?Field=Titleamp。ClassID=amp。keyword=%BF%CB%C2%A1amp。Submit=+%CB%D1%CB%F7+’克隆。 1975197。1977年完成了全長5387bp的噬菌體φ174基因組測定。 1978首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達的人腦激素和人胰島素。 1980美國聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程可以專利化。 1981R.D.Palmiter和R.L.Brinster獲得Aamp。NBSP。CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’amp。NBSP。HREF=’HTTP: Article ?Field=Titleamp。ClassID=amp。keyword=%D7%AA%BB%F9%D2%F2amp。Submit=+%CB%D1%CB%F7+’ 轉(zhuǎn)基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到Aamp。NBSP。CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’amp。NBSP。HREF=’HTTP: Article ?Field=Titleamp。ClassID=amp。keyword=%D7%AA%BB%F9%D2%F2amp。Submit=+%CB%D1%CB%F7+’ 轉(zhuǎn)基因果蠅。 1982美、英批準(zhǔn)使用第一例基因工程藥物胰島素；Sanger等人完成了入噬菌體48,502bp全序列測定。 1983獲得第一例Aamp。NBSP。CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’amp。NBSP。HREF=’HTTP: Article ?Field=Titleamp。ClassID=amp。keyword=%D7%AA%BB%F9%D2%F2amp。Submit=+%CB%D1%CB%F7+’ 轉(zhuǎn)基因植物。 1984斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于重組DNA的專利。 1986GMO首次在環(huán)境中釋放。 1988J.D.Watson出任人類基因組計劃首席科學(xué)家。 1989DuPont公司獲得轉(zhuǎn)腫瘤基因小氧Onouse。 1992歐共體35個實驗室聯(lián)合完成酵母第三染色體全序列測定(315kb) 1994第一批基因工程西紅柿在美國上市。 1996完成了酵母基因組(107bp)全序列測定。 1997英國